碳黑和碳黑与铅复合物对人肺腺癌细胞A549毒性作用的比较

木 魁，姜 楠，温海燕，李 响，高祥志，姜双林

阜阳师范学院1.生命科学学院，2.胚胎发育与生殖调节安徽省重点实验室，阜阳,236037

碳黑和碳黑与铅复合物对人肺腺癌细胞A549毒性作用的比较

木 魁1,2，姜 楠1,2，温海燕1,2，李 响1,2，高祥志1，姜双林1,2

阜阳师范学院1.生命科学学院，2.胚胎发育与生殖调节安徽省重点实验室，阜阳,236037

【目的】比较碳黑和碳黑与铅复合物对人肺腺癌细胞A549的氧化损伤和凋亡方面的毒性。【方法】分别将浓度为40 μg/mL的碳黑和碳黑与铅的复合物(硝酸铅∶碳黑为250 ng∶1 g)暴露A549细胞，MTT法测定24、48、72 h时的细胞毒性；检测细胞上清中乳酸脱氢酶(LDH)活力，胞内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化氢酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)的活性和总蛋白含量；荧光染色法检测细胞产生的活性氧(ROS)的含量；Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡。【结果】处理组暴露24 h后A549细胞的存活率均降低，碳黑与铅复合物最低，处理48 h和72 h与处理24 h的趋势一致；处理组LDH和MDA均显著高于对照组(P<0.05)，其中碳黑与铅复合物最高；处理组CAT活性、SOD活性和GSH-Px含量均显著低于对照组(P<0.01)，碳黑与铅复合物最低；碳黑处理组ROS高于对照组，碳黑与铅复合物处理组ROS最高；碳黑处理组凋亡率是空白组的2.73倍，碳黑与铅复合物处理组凋亡率是对照组的4倍。【结论】碳黑与铅复合物和碳黑对A549细胞均产生细胞毒性，导致胞内抗氧化酶下降，细胞凋亡率增高，碳黑与铅复合物比碳黑对A549细胞具有更强的毒性损伤。

碳黑；A549；毒性

我国黑碳颗粒的排放约占全球的四分之一，总量达到181.1×104t[1-2]。黑碳颗粒是PM2.5的主要组分之一，也是PM2.5传输和吸附有毒有害物质的载体，能诱发呼吸系统疾病的发生[3]。它的孔隙发达,粒径小,比表面积大，能极强地吸附重金属离子(如Pb、Cd、Zn、Mn、Cr等)，形成黑碳-污染物复合体[4]。

空气中的铅主要来源于燃油和燃煤排放，它与空气中的黑碳结合，形成二次黑碳粒子，即黑碳与铅复合物。Liu等通过黑碳(一次性黑碳)暴露于O3后制备的二次黑碳(黑碳-臭氧复合体)，氧化损伤和细胞毒性效应明显增强[5]。Diabaté等研究了黑碳标准品、粉煤灰及其不同组分诱发人肺上皮细胞炎症反应的机制，发现粉煤灰中不溶性过渡金属组分Pb、Zn、Fe能诱导ROS的含量升高，并诱导产生HO-1、Nrf2以及IL-6、IL-8、COX-2和TNF-α等细胞因子基因的高表达；黑碳也能诱导ROS的产生，但不能诱导产生HO-1[6]。

本实验采用商品化碳黑和碳黑与铅复合物暴露A549细胞，通过对A549细胞内产生的活性氧含量、生理生化指标和凋亡率检测，从而评估其毒性。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

A549细胞培养液:RPMI1640培养基(南京建成生物工程研究所)，10%标准胎牛血清(南京建成生物工程研究所)，胰蛋白酶(Sigma公司)，噻唑蓝(MTT,上海生物工程公司)，三联溶解液(10%SDS，5%异丁醇，0.01 mol/L HCL)，总蛋白、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化氢酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)测试盒(南京建成生物工程研究所)，细胞凋亡试剂盒(BD Pharmingen)，噻唑蓝(上海生物工程公司)，Multiskan GO型酶标仪(美国Thermo公司)。

1.2 碳黑和碳黑与铅复合物悬液制备

实验用碳黑为商品化碳黑C824455(麦克林)，碳黑与铅的复合物在常温下与硝酸铅标准液混合，80℃水浴加热搅拌至碳黑悬浮于溶液中，蒸干至恒重，然后转到坩埚再置于马弗炉中300℃加热3 h制备成硝酸铅与碳黑比例为250 ng∶1 g的样品。经过与硝酸铅复合的碳黑能稳定结合，粒径增大。用含10%胎牛血清的RPMI1640完全培养基配置碳黑和碳黑与铅的复合物1 mg·mL-1浓储液，超声30 min后备用。

1.3 细胞培养与暴露

用含10%胎牛血清的RPMI1640完全培养基，在CO2为5%，温度为37℃的CO2培养箱中培养A549细胞。

1.4 MTT法检测细胞活性

将上述1 mg·mL-1的浓储备液稀释成终浓度为40 μg·mL-1，以完全培养基作为空白对照，取对数期A549细胞，用0.25%的胰酶消化，然后离心、去上清、重悬、计数，制备成密度为1.0×105个/mL的细胞悬浮液，在96孔板上每个浓度设置4个重复和1个空白孔，分别培养24、48、72 h。每孔加入MTT 10 μL后继续37℃孵育4 h，加入三联溶解液100 μL再次37℃孵育4 h，直接在570 nm 处用酶标仪测量光度值。

1.5 细胞生理生化指标检测

A549细胞分别暴露在空白组、40 μg/mL的碳黑和碳黑与铅的复合物下24 h，收集上清，按照LDH试剂盒说明书操作，弃上清的细胞经过裂解液裂解收集，按照试剂盒说明书操作，测MDA、GSH-Px、CAT、SOD和总蛋白定量。

1.6 细胞内活性氧含量的检测

A549细胞分别暴露在空白组、40 μg/mL的碳黑和碳黑与铅的复合物下24 h，加入DCFH-DA探针，37℃孵育1 h，去除培养基，PBS冲洗两次，加入胰酶消化，经过离心后弃掉细胞上清液，然后加入PBS吹打，使细胞重悬后进行荧光检测。

1.7 细胞凋亡检测

A549细胞分别暴露在空白组、40 μg/mL的碳黑和碳黑与铅的复合物下24 h，按照试剂盒说明书操作，用流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.8 统计分析

用GraphPad Prism软件对实验数据进行分析。差异显著性用2way ANOVA分析方法进行比较，其中P<0.05表明具有显著性差异，P<0.01表示具有极显著性差异。

2 结果与分析

2.1 碳黑和碳黑与铅复合物对A549细胞活性的影响

图1表明，碳黑处理24 h组A549细胞活性明显低于空白组，碳黑与铅复合物组A549细胞最低；处理时间为48 h和72 h与处理24 h碳黑和碳黑与铅复合物趋势一致，均表现为A549细胞活性降低的趋势。说明碳黑与铅复合物对A549细胞的毒性比碳黑更强。

图1 碳黑和碳黑与铅复合物对A549细胞活性影响

2.2 碳黑和碳黑与铅复合物对A549细胞生化指标的影响

2.2.1 碳黑和碳黑与铅复合物对A549细胞损伤指标

如图2A，碳黑处理组和碳黑与铅复合物处理组LDH活性水平均显著高于空白对照组(P<0.05)，碳黑与铅复合物处理组LDH活性水平高于其他两组(P<0.05)。如图2B，碳黑处理组和碳黑与铅复合物处理组MDA含量均显著高于空白对照(P<0.01)，碳黑处理组比对照组MDA含量高1.8倍，碳黑与铅复合物处理组比对照组MDA含量高1.9倍。各组间具有统计学差异(P<0.05)。

图2 碳黑和碳黑与铅复合物对A549细胞LDH和MDA含量影响

2.2.2 碳黑和碳黑与铅复合物对A549细胞酶活力的影响

如图3A，碳黑处理组和碳黑与铅复合物处理组SOD含量均低于对照组(P<0.01)，碳黑处理组比对照组SOD活性低17.40%，碳黑与铅复合物处理组比对照组SOD活性低34.39%。如图3B，碳黑处理组和碳黑与铅复合物处理组GSH-Px活性均低于对照组，碳黑处理组比对照组GSH-Px活性低29.06%，碳黑与铅复合物处理组比对照组GSH-Px活性低67.93%。如图3C，碳黑处理组和碳黑与铅复合物处理组CAT活性均低于对照组，碳黑处理组比对照组CAT活性低30.55%，碳黑与铅复合物处理组比对照组CAT活性低74.10%，各组间具有统计学差异(P<0.01)。

图3 碳黑和碳黑与铅复合物对A549细胞酶活力影响

2.3 碳黑和碳黑与铅复合物对A549细胞ROS的影响

如图4，激发波长为485 nm，发射波长为525 nm，碳黑处理组ROS荧光强度高于对照组，碳黑与铅复合物处理组ROS荧光强度明显高于碳黑组和对照组。

2.4 碳黑和碳黑与铅复合物对A549细胞凋亡的影响

如图5，采用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒检测碳黑和碳黑与铅复合物对A549细胞凋亡的影响，对照组仅有4.5%的细胞发生凋亡，碳黑处理组凋亡率为12.3%，碳黑与铅复合物处理组为18.0%，均明显高于对照组。

图4 碳黑和碳黑与铅复合物对A549细胞凋亡的影响

图5 碳黑和碳黑与铅复合物对A549细胞凋亡的影响

3 结束语

黑碳是大气细颗粒物PM2.5的主要组分之一，由生物质或化石燃料不完全燃烧产生的一种含碳的混合物[7]，能极强地吸附有毒有害物质(如重金属离子、多环芳烃族、无机盐等)，形成黑碳—污染物复合体[4]。黑碳颗粒形成的粒径小于2.5 μm的大气细颗粒物能随呼吸进入肺泡，严重影响人体健康。关于PM2.5的毒性效应已得到学术界的广泛证实，由于其组成复杂多样，对其危害机理研究存在一定的困难。本文选取商品化碳黑，让其与典型重金属铅的复合，比较两者在A549细胞毒性影响，从而为研究PM2.5毒性损伤机理提供参考。

由于碳黑具有良好的吸附性，能吸附空气中微量重金属铅，形成碳黑与铅复合物。将此复合物暴露A549细胞后，导致A549细胞内产生大量ROS，胞内SOD、GSH-Px、CAT活性均显著下降，细胞培养基上清LDH和胞内MDA含量显著升高，细胞膜损伤，引起细胞大量凋亡。用MTT法检测，存活细胞明显减少，细胞毒性等各项指标显著高于碳黑处理组。以上研究为PM2.5的毒性效应及其产生机制研究提供了一个新思路。关于碳黑与铅复合物毒性显著高于碳黑的机理尚需作进一步研究。

[1] Streets DG, Gupta S, Waldhoff ST, et al. Black carbon emissions in China[J].Atmos Environ, 2001, 35: 4281-4296

[2] Menon S,Hansen J,Nazarenko L,et al.Climate effects of black carbon aerosols in China and India[J].Science,2000,297:2250-2253

[3] Dockery DW, Pope CA, Xu X. An association between air pollution and mortality in six US cities[J]. N Engl J. Med,2003,329:1753-1759

[4] Pope CA,Hansen ML.Ambient particulate air pollution,heart rate variability,and blood markers of inflammation in a panel of elderly subjects[J].Environ.Health Persp, 2004,112:339-345

[5] Liu Y,Liu C,Ma Q,et al.Structural and hygroscopic changes of soot during heterogeneous reaction with O3[J]. Phys Chem Chem Phys,2010,12:10896-10903

[6] Diabaté S,Britta BB,Plaumann D,et al.Anti-oxidative and inflammatory responses induced by fly ash particles and carbon black in lung epithelial cells[J]. Anal Bioanal Chem, 2011,401:3197-3212

[7] Goldberg E D.Black carbon in the environment:properties and distribution[J].NewYork:John Wiley,2000

(责任编辑：汪材印)

X171.5

：A

：1673-2006(2017)07-0121-05

10.3969/j.issn.1673-2006.2017.07.032

2017-03-29

国家自然科学基金重大研究计划项目“黑炭和黑炭-污染物复合体诱发肺部炎症反应的作用机理研究”(91643113)。

木魁(1990-)，安徽亳州人，在读硕士研究生，研究方向：环境毒理学。