RP-HPLC法测定枸橼酸离子检验条件研究

武凤梅 何佳

哈尔滨瀚邦医疗科技有限公司 150028

RP-HPLC法测定枸橼酸离子检验条件研究

武凤梅 何佳

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目的：考察血液制品与磺基水杨酸的反应温度对枸橼酸离子含量检验结果的影响。方法：首先通过实验确定样品温度对枸橼酸离子含量的结果的影响，再根据确定的反应温度，依据《中国药典》（2015年版）进行方法学研究。结果：样品与磺基水杨酸的反应温度为37℃时，方法学研究符合相关规定。结论：为保证样品与磺基水杨酸反应完全，结果真实可靠，样品与磺基水杨酸的反应温度设定为37℃。

枸橼酸离子；血液制品与磺基水杨酸的反应温度

《中国药典》2015版三部[1]中枸橼酸离子含量测定法有三个方法，其中第二法高效液相法是用示差折光检测器，通过苯乙烯-二乙烯基苯共聚物为基质的阳离子交换色谱柱（H+）将血液制品中的枸橼酸离子分离出来，在实验过程中磺基水杨酸与样品反应条件直接影响枸橼酸离子的分离效果，不同检验条件对检验枸橼酸离子含量结果影响较大[2-5]。本试验通过对不同温度条件及反应时间的考察，确定血液制品样品与磺基水杨酸的反应具体条件。

1.仪器与试剂

高效液相色谱仪：示差折光检测器（岛津RID-10A），

试剂：枸橼酸钠（SIGMA）：批号：BCBP0175V

硫酸、磺基水杨酸为国产分析纯试剂

2.色谱条件

2.1.色谱条件：阳离子交换色谱柱（H+）：BIO（300mm× 7.8mm，9um）；流动相为0.004mol/L硫酸，流速0.8ml/min；柱温50℃。

3.溶液的配制及样品处理：

3.1.对照品溶液的制备：精密称取经减压干燥至恒重的枸橼酸钠0.735g，置100ml量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，精密量取5ml、10ml、15ml，分别置25ml量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得相对应的5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L枸橼酸离子对照品溶液[6,7]。分别精密量取20uL，注入液相色谱仪，记录色谱图；

3.2.供试品溶液的制备：取血液制品的供试品溶液 1ml，置15ml离心管中，精密加入1.5%磺基水杨酸溶液 1ml，摇匀，37℃静置2h，以每分钟2000离心10分钟，取上清液，过滤，同法测定。

3.3.以对照品溶液的枸橼酸离子浓度对其相应的峰面积作直线回归，求得直线回归方程，计算出供试品溶液中枸橼酸离子含量（mmol/L），再乘以相应的供试品稀释倍数2，计算出供试品中枸橼酸离子含量（mmol/L）。

4.实验过程

4.1.实验目的：考虑到季节变化对室温的影响较大，考察样品与1.5%磺基水杨酸的反应温度是否会影响检验结果。

4.1.1.考察25℃、37℃、50℃时，对实验结果是否产生影响，以某血液制品的不同批号的样品为例：

表1 三批样品与磺基水杨酸的不同反应温度对实验结果的影响

上述实验数据可以看出，样品与 1.5%磺基水杨酸的反应温度会对实验结果有影响，而反应温度为40℃时的实验结果，更接近理论值，因此对反应温度为37℃时继续进一步研究。

4.2.线性关系考察：按照“3.1”项下的步骤对和对照品进行处理，并取不同浓度的对照品 20ul进样分析，其线性回归方程为y=44906.6x+584.732 r=1.0

因此对照品的浓度适用于该浓度的样品测定。

4.3.精密度：取中间浓度的枸橼酸离子对照品，连续进样 5次，枸橼酸离子的保留时间RSD＜0.1%，峰面积的RSD＜0.1%，精密度符合色谱条件的规定。

4.4.重复性：按“3.2”的操作处理某一批样品，重复6次，计算同一批次样品的6个实验结果，6个数据的枸橼酸离子的含量RSD为0.8%。重复性良好。

4.5.准确度：在样品中，加入80%、100%、120%的对照品溶液，计算回收率，结果如下表：

表2 回收率实验数据

准确度良好。

4.6.中间精密度：不同化验员对同一批次样品进行检验，同一化验员不同时间对同一批次样品进行检验，相对偏差均符合规定。

5.结果与结论：根据以上方法学实验表明，枸橼酸离子含量的实验数据与样品和磺基水杨酸在37℃条件下，反应2h的实验数据的准确度更准确[8]，因此反应条件定位37℃、2h。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].四部.北京：中国医药科技出版社，2015：通则3108.

[2]王欣美,毛秀红,王柯.离子色谱法同时测定中药注射剂中亚硫酸盐及枸橼酸含量的研究[J].中国卫生检验杂志,2012(3):64-66.

[3]颜金良,王立.离子色谱法同时测定血清和尿中草酸及枸橼酸含量研究[J].中国卫生检验杂志,2010(3):478-480.

[4]王荔,宋国新,邓春晖.阴离子交换离子色谱法测定卷烟纸中乙酸盐、磷酸盐和柠檬酸盐含量[J].理化检验:化学分册,2009(7):815-817.

[5]朱雪妍.离子色谱法测定血栓通注射液中辅料氯化钠和枸橼酸钠的含量[J].药物分析杂志,2015(7):1236-1239.

[6]宁洪鑫,王伟,杨颖,等.HPLC法测定注射液A中枸橼酸根和醋酸根的含量[J].天津药学,2006,18(5):8-9.

[7]张伟,任连杰,张彤,等.高效阴离子交换色谱法测定人凝血因子Ⅷ中枸橼酸离子的含量[J].中国生物制品学杂志,2014,27(1):125-128.

[8]王敏力,杨鹏云,侯继锋.RP-HPLC法定量测定枸橼酸离子含量[J].药物分析杂志,2011(4):788-791.

R473.5

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1672-5018（2017）03-221-01