17β-雌二醇对乳腺癌细胞迁移的影响及CANP-FN通路的介导作用

于庆龙，张 莹，王宏健，金 爱，宛 蕾，王旭东

(贵州医科大学基础医学院1.生理学教研室、2. 药理学教研室，贵州 贵阳 550025)

17β-雌二醇对乳腺癌细胞迁移的影响及CANP-FN通路的介导作用

于庆龙1，张 莹1，王宏健1，金 爱1，宛 蕾2，王旭东1

(贵州医科大学基础医学院1.生理学教研室、2. 药理学教研室，贵州 贵阳 550025)

目的探讨17β-雌二醇(E2)对人乳腺癌细胞迁移活动的影响及其信号机制。方法以雌激素受体(ER)阳性MCF-7和ER阴性MDA-MB-468乳腺癌细胞为研究模型，E2处理诱导细胞迁移。采用划痕实验检测细胞迁移能力，小分子RNA(siRNA)转染模型细胞沉默纤连蛋白(FN)基因表达，Western blot法检测蛋白水平，钙蛋白酶(CANP)特异性抑制剂Calpeptin(Cal)预处理细胞干预胞内CANP活性。结果① E2(50 nmol·L-1)处理24 h可明显促进MCF-7和MDA-MB-468乳腺癌细胞迁移，迁移率分别增加(51.55±5.50)%(P<0.05)和(40.78±4.78)%(P<0.01)；② E2明显上调MCF-7和MDA-MB-468乳腺癌细胞FN蛋白表达水平，分别为对照组的2.11倍(P<0.05)和1.86倍(P<0.01)；③ Cal(10 μmol·L-1)可明显抑制E2诱导的MCF-7和MDA-MB-468乳腺癌细胞迁移，抑制率分别为(49.55±6.44)%(P<0.05)和(36.85±4.40)%(P<0.01)；④ Cal能明显抑制MCF-7和MDA-MB-468乳腺癌细胞FN蛋白表达上调，抑制率分别为(80.12±4.55)%和(78.84±5.70)%(P<0.01)；⑤ siRNA沉默FN能抑制E2诱导MCF-7和MDA-MB-468乳腺癌细胞迁移，抑制率分别为(40.65±5.80)%(P<0.01)和(40.88±6.02)%(P<0.05)。结论E2可促进ER阳性或阴性乳腺癌细胞的迁移，而CANP-FN信号通路可能参与介导E2的促细胞迁移效应。

17β-雌二醇；钙蛋白酶；纤连蛋白；细胞迁移；乳腺癌；雌激素受体

众所周知，恶性肿瘤发生远端转移是导致癌症患者死亡的主要原因，肿瘤转移包括肿瘤细胞的脱落、迁移、黏附、侵袭、血管生成等[1-3]。17β-雌二醇(17β-estradiol，E2)是女性体内的重要性激素，在生理情况下，E2对女性生殖系统和乳腺的生长发育及功能调节产生重要影响；病理状态下，E2参与诱导多种癌细胞的增殖、迁移、侵袭等恶性生物学行为[4]。钙激活中性蛋白酶(calcium-activated neutral protease，CANP或Calpain)是一种钙离子依赖性胞内半胱氨酸蛋白酶。通过有限蛋白水解(多在肽链N端)底物蛋白，对蛋白产生翻译后修饰作用，从而调节底物蛋白的活性或稳定性。新近资料显示，E2促进乳腺癌在内的多种肿瘤细胞迁移和侵袭可能受胞内CANP影响，高活性CANP与乳腺癌的不良预后显著相关[5-7]。纤连蛋白(fibronectin, FN)是细胞外基质的主要成分，FN上调与多种癌细胞增殖和迁移侵袭活动有关[8-9]。然而，E2促进乳腺癌细胞迁移是否与CANP-FN信号通路有关，目前尚未见文献报道。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞系人乳腺癌细胞系 MCF-7(ER阳性)和MDA-MB-468 (ER阴性)，购自中国科学院上海细胞库。

1.1.2试剂 DMEM培养基、青霉素-链霉素，购自Hyclone公司；L15培养基(Leibovitz′s L-15)，购自北京索莱宝公司；胎牛血清(FBS)，Gibco公司；活性炭处理胎牛血清(charcoal-stripped fetal bovine serum，CS-FBS)，四季青公司；siRNA序列设计、合成及转染试剂，上海吉玛公司；17β-雌二醇(E2)，Sigma Aldrich公司；FN抗体、CANP2抗体、羊抗小鼠IgG-HRP 抗体，Santa Cruz公司；GAPDH 抗体，Bioworld公司；RIPA裂解液、BCA试剂盒，购自碧云天生物技术有限公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 MCF-7乳腺癌细胞培养在DMEM(高糖，含10% FBS和1%青霉素-链霉素)中。MDA-MB-468乳腺癌细胞培养在L15(高糖，含10% FBS和1%青霉素-链霉素)中。模型细胞置于37℃、5% CO2的培养箱中培养。

1.2.2E2处理 细胞在有酚红完全培养基中培养至60%融合后，换成加2.5% CS-FBS的无酚红DMEM培养24 h，再以无血清、无酚红DMEM继续培养24 h，然后按实验要求加入一定剂量的E2处理24 h。

1.2.3划痕实验检测细胞迁移能力 细胞接种于12孔板中，有酚红条件下培养至90%～100%融合后，无菌条件下用200 μL枪头在培养皿底作轻柔十字划痕，形成单细胞层无细胞区(宽约1.5 mm)，然后以PBS清洗2～3次，以除去漂浮细胞。根据实验要求，更换有酚红或无酚红培养基(含1.5% CS- FBS)继续培养，按实验要求加入药物处理。于倒置显微镜下，分别在0、24 h时间点照相，观察和分析对照组和处理组划痕宽度的变化。各组24 h细胞迁移距离=0 h划痕宽度- 24 h划痕宽度；设定对照组迁移率为100%。处理组24 h细胞迁移率/%=24 h处理组细胞迁移距离/24 h对照组细胞迁移距离×100%。

1.2.4siRNA转染 转染前1 d，用0.5 mL含FBS和抗生素的DMEM或L15细胞培养基将细胞接种在24孔板上。选择用于初期接种的细胞数量，应能在24 h内使细胞汇合达到70%～90%。转染前，换成无抗生素、无血清的培养基。siRNA的转染浓度为40 pmol，准备siRNA-lipo2000混和液，稀释转染试剂Lipofectamine 2000(lipo2000)，使用前，将lipo2000试剂摇匀，然后取适量，用不含血清的培养基稀释，轻轻混和，室温孵育5 min；用不含血清的培养基稀释siRNA，加入量为40 pmol，轻轻混和；稀释好的lipo2000经过5 min的孵育后，与稀释好的siRNA轻轻混和，室温20 min以形成siRNA-lipo2000混和物。将siRNA-lipo2000混和液加入含有细胞以及培养液的细胞培养板中，轻轻摇晃，使之混和。将培养板置于37°C的CO2培养箱中至检测时间24 h。

1.2.5蛋白印迹检测 细胞培养融合至70%，按实验要求处理细胞后，加入RIPA细胞裂解液(使用前20 min加蛋白酶抑制剂，使其终浓度为1 mmol·L-1)，在冰上温育15 min以充分裂解，然后在4℃、20 627×g离心15 min。取样品上清液留用，采用BCA试剂盒进行蛋白定量。进行Western blot检测时，每个泳道按30 μg蛋白质样品进行上样，SDS-PAGE电泳分离蛋白，然后将分离蛋白电转移至硝酸纤维膜(美国Millipore公司)上；5%脱脂牛奶室温封闭1 h后，以TBST缓冲液洗膜3次，每次10 min；然后按要求加入FN抗体(1 ∶500)或抗Calpain2(1 ∶2 000)室温杂交1～2 h或4℃孵育过夜。一抗处理后，TBST洗膜3次，再加入相应的辣根过氧化物酶标记二抗(1 ∶2 000)，室温杂交1 h，PVDF膜以化学发光试剂盒(美国Millipore公司)进行显色，Syngene Imaging System进行成像，以Quantity One对蛋白印迹条带进行处理和分析。

2 结果

2.1E2增强MCF-7和MDA-MB-468乳腺癌细胞的迁移能力以E2(50 nmol·L-1)刺激细胞24 h，能明显增加MCF-7和MDA-MB-468乳腺癌细胞的迁移能力(Fig 1A)。与对照组相比，E2处理组MCF-7和MDA-MB-468乳腺癌细胞迁移率分别增加(51.55±5.50)%和(40.78±4.78)%(Fig 1B)。

Fig 1 E2 treatment stimulated migration in breast cancer cells

A：Treatment of MCF-7 and MDA-MB-468 cells with E2 increased cell migration；B：Migration rate of MCF-7 and MDA-MB-468 breast cancer cells.*P<0.05,**P<0.01vscontrol

2.2E2对乳腺癌细胞FN蛋白表达的影响E2能够明显上调MCF-7和MDA-MB-468乳腺癌细胞FN蛋白的表达，相对于对照组分别上调2.11和1.86倍(Fig 2)。

2.3Calpeptin抑制E2诱导的乳腺癌细胞迁移以CANP抑制剂Calpeptin(Cal 10 μmol·L-1)预处理细胞，结果发现E2诱导的乳腺癌细胞迁移受到明显抑制(Fig 3A)，在MCF-7和MDA-MB-468乳腺癌细胞，抑制率分别达到(49.55±6.44)%和(36.85±4.40)%(Fig 3B)。

Fig 2 Effect of E2 treatment onexpressionof FN in breast cancer cells

A:Treatment of MCF-7 and MDA-MB-468 cells with E2 enhanced the expression of FN；B: Relative protein expression of FN in MCF-7 and MDA-MB-468 cells.*P<0.05,**P<0.01vscontrol

2.4Calpeptin抑制E2诱导的乳腺癌细胞FN上调Cal(10 μmol·L-1)预处理可有效抑制E2诱导的MCF-7和MDA-MB-468乳腺癌细胞FN蛋白上调，其抑制率分别为(80.12±4.55)%和(78.84±5.70)%(Fig 4)。

2.5FN-siRNA转染抑制E2诱导的乳腺癌细胞迁移在MCF-7和MDA-MB-468乳腺癌细胞中，特异性转染FN(FN-siRNA)能有效地抑制E2诱导的FN蛋白表达上调，抑制率分别为(83.45±3.30)%和(80.15±4.04)%(Fig 5A)。同时给予E2，FN-siRNA组乳腺癌细胞迁移率较空载对照(NCSI)组细胞降低。转染FN-siRNA后，MCF-7乳腺癌细胞迁移率降低(40.65±5.80)%，MDA-MB-468乳腺癌细胞迁移率降低(40.88±6.02)%(Fig 5B)。

3 讨论

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。近几十年来，人类在乳腺癌的早期诊断和治疗方法方面已取得较大进步，但乳腺癌死亡率并没有明显下降，同时乳腺癌发病率呈现快速增高趋势[10]。防治乳腺癌远处转移是提高患者存活率及改善生活质量的关键，因而对乳腺癌转移的细胞分子机制进行深入研究具有重要的临床指导意义。业已证明，E2是促进乳腺癌恶性演进的重要因素之一，但其作用机制尚未完全明了。研究显示，下调或抑制CANP可促进乳腺癌细胞凋亡，如HER2(+)(SKBR3)和三阴性乳腺癌细胞(MDA-MB-231)[11]；Bugide 等[12]的研究中，CANP2被发现在MAPK的介导下可以调节细胞迁移及黏附，提示CANP与包括乳腺癌在内的多种肿瘤的恶性演进有关。本课题组前期研究发现，E2可上调并激活CANP，从而影响MCF-7乳腺癌细胞的增殖活动[13]。本研究结果显示，在MCF-7和MDA-MB-468乳腺癌细胞，E2处理可明显上调FN蛋白表达并促进细胞迁移，而CANP抑制剂Calpeptin能明显抑制E2诱导模型细胞FN表达及细胞迁移，提示CANP及FN可能与E2增强乳腺癌细胞的转移能力有关。

Fig 3 Effect of Calpeptin on migration induced by E2 in breast cancer cells

A：Pretreatment with calpeptin decreased E2-induced cell migration；B：Migration rate of MCF-7 and MDA-MB-468 breast cancer cells.**P<0.01vsE2

Fig 4 Effect of Calpeptin on FN Protein induced by E2

A: Calpeptin pretreatment inhibited E2-induced fibronectin upregulation; B: Relative protein expression of FN in MCF-7 and MDA-MB-468 cells.*P<0.05,**P<0.01vsE2

为了进一步探明FN在E2-CANP信号通路中的作用，本研究采用siRNA沉默FN基因表达，发现沉默FN可使E2诱导的细胞迁移效应受到明显抑制。本课题组曾报道，E2可通过CANP-周期蛋白E/FAK通路，促进乳腺癌细胞的增殖和迁移[13-14]。有研究显示，E2可诱导细胞上皮-间质转化，促进乳腺癌、肺癌、卵巢癌等肿瘤细胞的增殖和迁移侵袭行为[8-9,15]。这些提示我们，乳腺癌细胞内FN的表达可能受周期蛋白E或FAK蛋白调控；CANP及其下游信号通路或参与细胞上皮-间质转化。本研究显示，无论是ER阳性或阴性乳腺癌细胞，E2均可诱导FN蛋白上调，而此效应依赖于CANP，且抑制CANP活性可逆转E2诱导的FN上调。同时，FN基因沉默可明显抑制E2诱导的细胞迁移活动。这些结果提示，CANP-FN信号通路参与介导E2诱导的乳腺癌细胞迁移效应，干预胞内CANP-FN信号通路可能有助于遏制E2的促癌作用。

Fig 5 Effect of FN on migration of breast cancer cells

A: siRNA FN transfection down-regulated E2-enhanced FN protein expression; B: Transfection of siRNA against FN inhibited cell migration induced by E2.*P<0.05,**P<0.01vsNCSI

(致谢：本实验在贵州医科大学生理学教研室所属实验室完成，感谢生理学教研室所有的老师和同学对本课题研究给予悉心指导和帮助。)

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Roleofcalpain-fibronectinsignalinginestrogen-inducedmigrationinbreastcancercells

YU Qing-long1, ZHANG Ying1,WANG Hong-jian1, JIN Ai1,WAN Lei2, WANG Xu-dong1

(1.DeptofPhysiology; 2.DeptofPharmacology,SchoolofBasicMedicine,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550025,China)

AimTo study the effect of estrogen on the migration of breast cancer cells and the possible underlying mechanisms. Methods Human breast cancer cell lines MCF-7(estrogen receptor, ER+) and MDA-MB-468(ER-) were employed as a model system. Cells were treated with E2 and pretreated with CANP inhibitor(calpeptin)where needed. Wound-healing assay was applied to evaluate cell migration, Western blot assay was performed to observe protein level, and fibronectin expression was silenced by specific siRNA transfection.Results① Treatmentof MCF-7 and MDA-MB-468 cellswith E2(50 nmol·L-1) increased cell migration by(51.55±5.50) %(P<0.01)and (40.78±4.78)%(P<0.05), respectively; ② E2 significantly up-regulated the expression of FN protein in MCF-7 and MDA-MB-468 breast cancer cells, which was 2.11 times(P<0.05)and 1.86 times(P<0.01), respectively;③ Pretreatment with calpeptin(10 μmol·L-1) decreased E2-induced cell migration by (49.55±6.44)%(P<0.05) in MCF-7 and (36.85±4.40)% (P<0.01)in MDA-MB-468 cells;④ Calpeptin pretreatment inhibited E2-induced fibronectin up-regulation by(80.12±4.55)% and(78.84±5.70) %(P<0.01), respectively;⑤ Knockdown of FN with siRNA suppressed cell E2-induced migration by(40.65±5.80)%(P<0.01)in MCF-7 and(40.88±6.02)%(P<0.05)in MDA-MB-468 cells.ConclusionE2 stimulates the migration of breast cancer cells with or without ER expression and a calpain-FN signaling pathway may be involved in the E2 action.

estrogen；calpain；fibronectin；cell migration；breast cancer；estrogen receptor

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.10.009

A

：1001-1978(2017)10-1371-06

R329.25；R392.11；R737.902.2；R977.3；R977.6；R977.12

时间：2017-9-5 9:25 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170905.0925.018.html

2017-05-14,

2017-07-01

国家自然科学基金资助项目(No 31660345，31360252)

于庆龙(1990-)，男，硕士生，研究方向：抗肿瘤药物药理学，E-mail:769437638@qq.com； 王旭东(1960-)，男，硕士，教授，研究方向：抗肿瘤药物药理学，通讯作者，E-mail: 1157102188@qq.com