miR-218对新藤黄酸抑制人宫颈癌HeLa细胞增殖作用的影响及机制研究

石玉荣，刘 健，陈素莲，杨 滢

(蚌埠医学院1. 生物化学与分子生物学教研室、2. 检验诊断学实验中心、3. 第一附属医院肿瘤外科，安徽 蚌埠 233003)

miR-218对新藤黄酸抑制人宫颈癌HeLa细胞增殖作用的影响及机制研究

石玉荣1，2，刘 健3，陈素莲1，2，杨 滢1

(蚌埠医学院1. 生物化学与分子生物学教研室、2. 检验诊断学实验中心、3. 第一附属医院肿瘤外科，安徽 蚌埠 233003)

目的研究miR-218对新藤黄酸抑制人宫颈癌HeLa细胞增殖作用的影响及其可能的分子机制。方法人宫颈癌HeLa细胞转染过表达真核表达载体pmiR-218, real-time PCR检测HeLa细胞miR-218的表达。将HeLa细胞分为空白对照组、新藤黄酸组、pmiR-218组、质粒对照组、新藤黄酸联合pmiR-218组。MTT法检测各组细胞增殖；流式细胞仪检测各组细胞凋亡；Western blot检测Bcl-2、Bax、E-cadherin表达；real-time PCR检测Bcl-2、Bax和E-cadherin 的mRNA表达水平。结果miR-218真核表达载体pmiR-218转染HeLa细胞后，细胞内miR-218表达水平明显增加(P<0.05)。miR-218可提高 HeLa细胞对新藤黄酸的敏感性，高表达miR-218能促进新藤黄酸对HeLa细胞的增殖抑制作用，促进细胞凋亡，下调新藤黄酸对HeLa细胞Bcl-2/ Bax蛋白的表达水平。结论miR-218可提高HeLa细胞对新藤黄酸的敏感性，miR-218能增强新藤黄酸对HeLa细胞增殖抑制作用，并促进HeLa细胞凋亡，其作用机制可能与下调 Bcl-2/Bax的表达有关。

新藤黄酸；miR-218；HeLa细胞；细胞增殖；细胞凋亡；Bcl-2/Bax

新藤黄酸(gambogenic acid，GNA)是中药藤黄中的主要成分之一，基础研究表明，GNA可抑制胃癌、肝癌、非小细胞肺癌、宫颈癌、乳腺癌等多种癌细胞增殖[1-3]。微小RNA(microRNAs， miRNAs)是一类长约21～23个核苷酸序列的单链非蛋白编码的RNA分子，在多种肿瘤中可有异常表达，对肿瘤的发生发展具有重要的调节作用。研究表明，miRNA-218(miR-218)在宫颈癌细胞中表达缺失或低表达，过表达 miR-218 可诱导细胞凋亡，抑制细胞增殖，具有抗宫颈癌的作用。本文以宫颈癌HeLa细胞为研究对象，转染miR-218真核表达载体，并联合使用GNA，探讨miR-218对GNA抑制人宫颈癌HeLa细胞增殖作用的影响及机制，为临床联合应用治疗宫颈癌提供实验依据。

1 材料与方法

1.1细胞与试剂人子宫颈腺癌HeLa细胞为本实验室冻存。GNA购自中国上海士锋生物科技有限公司；胎牛血清、RPMI 1640培养基，购自Gibco公司；脂质体LipofectamineTM2000、TRIzol，购自Invitrogen公司；miR-218 Real-time PCR试剂盒，购于上海吉玛制药技术有限公司；MTT试剂，购于Sigma公司；Annexin V/PI凋亡检测试剂盒，购于南京凯基生物科技发展有限公司；BCA蛋白浓度定量检测试剂盒，购于碧云天生物技术研究所；ECL化学发光剂，购自Thermo公司；Anti-Bcl-2、Anti-Bax、Anti-E-cadherin抗体，购自Santa Cruz公司；逆转录试剂盒和PCR试剂盒，购自Promega公司。

1.2Real-timePCR检测转染pmiR-218对HeLa细胞miR-218表达的影响实验分组:空白对照组、pmiR-218组和空质粒对照组，每个组设3个复孔。pmiR-218和空质粒的 DNA转染浓度为0.05 mg·L-1。将细胞以1.5 ×108·L-1接种于24孔板，按 LipofectamineTM2000说明书要求，转染质粒。转染48 h后，离心收集细胞，按TRIzol操作说明书提取各组细胞总RNA。按real-time PCR试剂盒操作说明书要求，检测细胞内 miR-218的表达水平。用2-△△Ct方法进行相对定量分析。

1.3MTT法检测pmiR-218对GNA抑制HeLa细胞增殖作用的影响将HeLa细胞按1×108·L-1接种于96孔板，设4个复孔，按LipofectamineTM2000操作说明书要求，转染质粒。实验分组：空白对照组、空质粒对照组、pmiR-218组。3组细胞分别加入不同浓度的GNA。GNA浓度为0、0.63、1.25、2.50 、5.0、10.0 mg·L-1。转染48 h后，进行MTT检测，全自动酶标仪检测553 nm处各孔的光密度(OD)值。增殖抑制率/%=(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值×100% 。药物增敏倍数=单纯用药组的IC50/联合用药组的IC50。

1.4流式细胞术检测GNA联合pmiR-218对HeLa细胞凋亡的影响实验分组：空白对照组、GNA组、pmiR-218组、空质粒对照组、 GNA+pmiR-218组。GNA浓度为2.0 mg·L-1。将HeLa细胞以1.5×108·L-1接种于24 孔板，转染方法同前。48 h后，离心收集细胞，用PBS洗涤3次，按Annexin V/PI凋亡检测试剂盒说明书加入试剂，流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.5Westernblot检测GNA联合pmiR-218对HeLa细胞内蛋白表达的影响实验分组及转染方法同前。转染48 h后，裂解细胞提取蛋白，按蛋白定量试剂盒说明书进行蛋白定量并校正。取等量蛋白样品加入样品裂解液，置沸水中煮5 min，SDS-PAGE电泳，转膜。TBST洗膜后，5%牛血清白蛋白封闭1 h，加入一抗4℃孵育过夜。TBST脱色，加入二抗，37℃孵育1 h。加入 ECL 显影，曝光，以β-actin作为内参照，对条带进行灰度分析。

1.6qRT-PCR检测GNA联合pmiR-218对HeLa细胞相关基因表达的影响实验分组同前。取5组宫颈癌HeLa细胞培养72 h后，收集细胞。按TRIzol操作说明书，提取各组细胞总RNA。按Real-time PCR试剂盒操作说明书要求，检测细胞内 Bcl-2、Bax、E-cadherin的mRNA表达水平。用β-actin基因作为内参，2-△△Ct方法进行相对定量分析。

2 结果

2.1HeLa细胞内miR-218的相对表达水平Fig 1的real-time PCR结果显示，HeLa细胞转染pmiR-218 后，细胞内 miR-218 的表达水平相对于对照组和空质粒组均明显增加，转染空质粒组和对照组相比无明显变化。表明HeLa细胞转染 pmiR-218 后，细胞内miR-218 的表达水平明显增高。

2.2转染pmiR-218，检测GNA对HeLa细胞的增敏作用单独使用GNA，IC50为5.68 mg·L-1，GNA和pmiR-218联合应用IC50为1.94 mg·L-1(P<0.05) ，增敏倍数为2.93，两者联用为协同作用(Tab 1)。提示，高表达miR-218能够提高HeLa细胞对GNA的药物敏感性。进一步应用2.0 mg·L-1GNA和pmiR-218联合，用MTT检测对细胞生长的影响。由Tab 2结果可知，单独使用GNA组和单独转染pmiR-218组，对HeLa细胞生长均有抑制作用，与空白对照组和空质粒组相比，差异有显著性(P<0.05)。GNA和pmiR-218联合作用HeLa细胞，增殖抑制作用明显增强，与GNA组和pmiR-218组相比，差异均有统计学意义(P<0.05)。

Fig 1 The relative expression level of miR-218 in HeLa cells

*P<0.05vscontrol

Tab 1 Inhibitory effects of gambogenic acidcombined with pmiR-218 on proliferation of HeLa cells

*P<0.05vs0 mg·L-1GNA

Tab 2 Gambogenic acid combined withpmiR-218 on HeLa cell growth

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsgambogenic acid;△P<0.05vspmiR-218

2.4GNA联合pmiR-218对宫颈癌HeLa细胞凋亡的影响5组HeLa细胞培养72 h后，收集各组细胞，流式细胞术检测细胞凋亡。由Fig 2可见，GNA组和转染pmiR-218组细胞凋亡率明显高于对照组，GNA和pmiR-218联合应用组，细胞凋亡率明显高于GNA组和pmiR-218组。

2.5Westernblot检测GNA和pmiR-218联合应用对HeLa细胞蛋白表达的影响如Fig 3所示，单独使用GNA和转染pmiR-218后，宫颈癌HeLa细胞Bcl-2蛋白表达均较对照组降低，而Bax和E-cadherin蛋白表达增加，与对照组相比，差异均具有显著性(P<0.05)。GNA和pmiR-218联合应用后，进一步降低HeLa细胞Bcl-2蛋白表达，上调Bax和E-cadherin蛋白表达，与单独使用GNA和pmiR-218组相比，差异均具有统计学意义(P<0.05)。

2.6qRT-PCR检测GNA联合pmiR-218对HeLa细胞Bcl-2、Bax和E-cadherin基因表达的影响如Fig 4所示，GNA组和转染pmiR-218组宫颈癌HeLa细胞Bcl-2的mRNA水平明显下降，与对照组相比，差异有显著性(P<0.05)；GNA和pmiR-218联合应用于宫颈癌HeLa细胞，Bcl-2的表达下降更加明显，与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)，与GNA组和pmiR-218组相比，差异均有显著性(P<0.05)；GNA组和转染pmiR-218组Bax和E-cadherin的mRNA表达水平增加，与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。GNA和pmiR-218联合应用组，Bax和E-cadherin的mRNA表达增加与对照组相比，差异有显著性(P<0.05)，与GNA和pmiR-218组相比，差异均具有显著性(P<0.05)。

Fig 2 Effects of gambogenic acid combined with pmiR-218 on apoptosis of cervical cancer HeLa cells

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsGNA;△P<0.05vspmiR-218

Fig 3 Effects of gambogenic acid combined with pmiR-218on expression of Bcl-2, Bax and E-cadherin protein in HeLa cells

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsGNA;△P<0.05vspmiR-218

3 讨论

藤黄酸是中药藤黄的主要成分，在细胞增殖、侵袭、多药耐药方面发挥抗肿瘤作用，现作为I类新药，进入临床试验阶段。现代研究证实，GNA也为藤黄抗肿瘤作用的主要有效成分，在多种癌细胞系和肝癌小鼠模型中，具有抑制肿瘤生长的作用，且有效治疗剂量及毒副作用明显低于藤黄酸，有望开发成抗肿瘤新药。但GNA作为化疗药物单独使用，其作用有限，且存在一定的毒副作用，而联合用药可能会降低GNA的用量，并减少毒副作用，同时提高其抗肿瘤作用。

Fig 4 Effects of gambogenic acid combinedwith pmiR-218 on mRNA expression of Bcl-2,Bax and E-cadherin in cervical cancer cell line HeLa

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsGNA;△P<0.05vspmiR-218

近年大量的研究显示，miRNAs在肿瘤发生发展过程中发挥重要作用。miRNAs 是一种小分子、非编码的RNA，通过与靶mRNA的3′UTR结合，阻碍mRNA翻译或者诱导 mRNA 分解，从而实现对基因转录后的调控。miRNA 与肿瘤细胞形成、侵袭、转移密切相关，miRNA通过与靶基因RNA碱基配对，引导沉默复合体降解RNA或阻碍其翻译[4]。miRNA在多个组织中的差异表达，使表达图谱分析成为研究的重点，miRNA在肿瘤耐药和上皮间质转化中发挥重要作用[5-6]。将 miRNA与化疗药物联合应用，发现miRNA 可以通过调控抑癌基因、癌基因或凋亡相关基因的表达，提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，逆转肿瘤细胞对化疗药物的耐药性[7]。

近年来，关于miR-218在肿瘤中的异常表达的现象备受关注。研究发现，多种恶性肿瘤中存在着miR-218表达下调的现象，如头颈鳞癌[8]、膀胱癌[9]、鼻咽癌[10]等。现研究证实，宫颈癌组织中microRNA表达谱发生明显改变，且其与宫颈癌的发生进展密切相关。研究表明，miR-218表达下调与HPV感染相关，miR-218表达降低与宫颈癌发生发展密切相关[11]。我们的前期研究也证实了miR-218在宫颈癌组织中表达下调，上调miR-218表达，可抑制宫颈癌细胞增殖，促进细胞凋亡，发挥抗肿瘤作用[12]。

本研究通过将 miR-218的真核表达载体(pmiR-218)转染 HeLa细胞，上调宫颈癌细胞中miR-218的表达，与GNA联用后，HeLa细胞对GNA的敏感性提高到单独使用GNA的2.93倍，两者表现为协同抗肿瘤作用。提示两者联合使用较单独使用GNA具有更强的抗宫颈癌效果。

GNA和pmiRNA-218共同作用于宫颈癌细胞，探讨二者联合应用对宫颈癌的抗肿瘤作用。流式细胞仪检测结果显示，单独使用GNA和转染pmiR-218均能诱导细胞凋亡，抑制细胞增殖。两者联合应用后，细胞凋亡率较单独用药组明显增加，提示GNA转染pmiR-218的协同抗肿瘤作用可能与共同诱导HeLa细胞凋亡相关。

细胞凋亡与多种细胞因子表达异常相关。Bax基因是人体最主要的抗凋亡基因，属于Bcl-2 基因家族，编码的Bax 蛋白可与Bcl-2 形成异二聚体，对Bcl-2 产生阻抑作用。研究发现，Bax/Bcl-2 两蛋白之间的比例关系是决定对细胞凋亡抑制作用强弱的关键因素，因此认为，Bax是重要的促细胞凋亡基因之一[13-14]。本研究结果显示，GNA和pmiR-218两者联合应用后，Bax蛋白表达上调，Bcl-2蛋白表达明显下调，较单独用药组相比，差异有显著性。qRT-PCR结果亦显示，两者联合应用能进一步上调Bax基因表达，下调Bcl-2蛋白表达。这些结果均提示，转染pmiR-218联合GNA的协同抗肿瘤作用，可能与共同诱导HeLa细胞凋亡相关。

发现新的抗肿瘤靶点、开发特异性的靶向抗肿瘤药物，并与传统药物联合应用，在当今肿瘤治疗研究中显示出良好的发展前景。本研究将GNA与靶向miRNA技术联合使用，提高HeLa细胞对GNA的敏感性，为靶向基因治疗与传统化疗联合应用抗肿瘤提供了实验依据，为宫颈癌的辅助治疗提供新的思路。

(致谢：本实验主要在蚌埠医学院临床检验诊断学中心实验室完成，在此对实验室的各位老师及同学的帮助致以衷心的感谢！)

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InhibitingeffectsofgambogenicacidincombinationwithmiR-218oncervivalcancerHeLacellsanditsmechanisms

SHI Yu-rong1,2, LIU Jian3, CHEN Su-lian1,2, YANG Ying1

(1.DeptofBiochemistryandMolecularBiology; 2.ResearchCenterofClinicalDiagnosticsLab;3.DeptofOncologicalSurgery;BengbuMedicalCollege,BengbuAnhui233003,China)

AimTo study the inhibitory effects of gambogenic acid in combination with miR-218 on cervical cancer HeLa cells and its mechanisms.MethodsEukaryotic expression vector of miR-218(pmi8-218) was transfected into HeLa cells. Transcript levels of miR-218 were quantified by real-time quantitative PCR. HeLa cells were incubated with different concentrations of gambogenic acid alone or in combination with pmiR-218. The cell growth inhibiting ratio of HeLa cells was assessed by MTT assay. Cell apoptosis was measured by fluorescence activated cell sorting. The expression levels of Bcl-2, Bax and E-cadherin were measured by Western blot and qRT-PCR.ResultsLevels of miR-218 transcript significantly increased in pmiR-218 transfected HeLa cells. Overexpression of miR-218 may enhance the sensitivity of HeLa cells to gambogenic acid. Over expression of miR-218 could enhance the effect of gambogenic acid on inhibition cell proliferation, promoting apoptosis of HeLa cells. pmiR-218 could enhance the regulation of Bax expression and decrease the expression of Bcl-2 in HeLa cells.ConclusionsOver expression of miR-218 may enhance the sensitivity of HeLa cells to gambogenic acid; miR-218 can enhance the effect of gambogenic acid on inhibition cell proliferation and promote the apoptosis of HeLa cells, and the mechanism may be related to down-regulation of Bcl-2/Bax expression.

gambogenic acid; miR-218; HeLa cells; proliferation; apoptosis; Bcl-2/ Bax

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.10.015

A

：1001-1978(2017)10-1405-05

R284.1；R329.24；R329.25；R394.2；R737.330.22

时间：2017-9-5 9:26 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170905.0925.030.html

2017-05-16,

2017-06-28

安徽省教育厅自然科学基金资助项目(No KJ2014A162)

石玉荣(1974-)，女，硕士，副教授，研究方向：肿瘤分子生物学，通讯作者，E-mail: shiyr@126.com