神经肽优洛可定对丘脑底核神经元自发放电影响与CRF-2R关系研究

田 飞, 刘春娜，刘新宇，陈秋元,丁宇豪

(1. 汕头大学医学院第二附属医院神经外科，广东 汕头 515041；2. 锦州医科大学药理学教研室，辽宁 锦州 121000)

神经肽优洛可定对丘脑底核神经元自发放电影响与CRF-2R关系研究

田 飞1, 刘春娜2，刘新宇2，陈秋元2,丁宇豪2

(1. 汕头大学医学院第二附属医院神经外科，广东 汕头 515041；2. 锦州医科大学药理学教研室，辽宁 锦州 121000)

目的研究神经内分泌生物活性肽优洛可定(urocortin，UCN)对丘脑底核(subthalamic nucleus, STN)神经元放电及STN中多巴胺(dopamine, DA)能、谷氨酸(glutamic acid, GLU)能神经传递的影响，研究UCN在STN中是否与GLU及DA存在汇聚作用，探讨UCN在帕金森疾病(Parkinson’s disease, PD)发生中可能发挥的作用。方法取40只SD大鼠，采用神经电生理实验方法中的微电泳技术，在微电泳UCN过程中，观察STN神经元放电的波形及频率变化，同时，微电泳Astressin(AST)及蛋白激酶 A(protein kinase A，PKA)抑制剂，观察促皮质素释放因子2型受体(corticotropin releasing factor 2 receptor，CRF-2R)是否参与UCN对STN 神经元放电的影响。另外，在微电泳DA和GLU过程中，给予UCN及AST，观察STN神经元放电的变化，明确是否存在DA能及GLU能与UCN的交汇作用。结果微电泳UCN过程中，82%(27/33)STN神经元频率减慢。STN平均放电频率由(3.65±0.27)Hz减少到(2.05±0.33)Hz，微电泳UCN前、后STN放电频率明显降低(P<0.01)。另外，UCN抑制作用可被AST明显拮抗 (P<0.01), UCN抑制作用也可被PKA阻断剂部分阻断。在微电泳抑制性神经递质DA和兴奋性GLU过程中，UCN能进一步协同DA的抑制效应，并明显拮抗GLU的兴奋作用(P<0.01)。结论UCN与DA能及GLU能在STN神经元中存在汇聚作用，UCN可能是通过与CRF-2R 结合，进而通过PKA信号通路，影响DA能、GLU能神经递质活动，抑制STN 神经元放电。

丘脑底核；多巴胺；谷氨酸；帕金森疾病；优洛可定；微电泳

丘脑底核(subthalamic nucleus，STN)是基底神经节(basal ganglia，Bgl)重要的核团之一，主要调控机体的运动功能及行为。苍白球(globus pallidus，Gpe)和黑质网状部之间的重要中继站就是STN，在调节Bgl神经核团之间的生理功能及病理活动中起关键的整合作用[1-2]。神经内分泌生物活性肽优洛可定(urocortin，UCN)是由下丘脑分泌，具有多种神经及心血管功能[3]。目前的研究表明，UCN 在生理及病理情况下可能对中枢神经系统(central nervous system, CNS)具有保护功能[4-5]。在本实验室既往的研究中发现，UCN对Bgl的另一个主要核团——纹状体(striatum, STR)的自发放电有抑制作用[6]，另外，也发现UCN能通过抑制STR的多巴胺(dopamine，DA)神经元功能，同时抑制兴奋性神经递质的兴奋毒性，可能在帕金森疾病(Parkinson’s disease, PD)中发挥治疗作用[7]。但目前，UCN对STN的神经元放电的影响及对STN内神经递质(如兴奋性神经递质GLU及抑制性递质DA)的调节作用未见报道。本实验选用神经电生理中常用且经典的微电泳技术，结合细胞外记录的实验方法，微电泳UCN、促皮质素释放因子2型受体(corticotropin releasing factor 2 receptor， CRF-2R)抑制剂 Astressin(AST)，监测两者对STN 神经元放电频率及波形影响，同时监测UCN对STN中抑制性DA能、兴奋性GLU能神经传递的改变，以探讨STN内兴奋及抑制性神经递质间的相互平衡及制约作用，及可能的神经通路机制。目前，很多研究已明确STN是导致PD的重要核团[8]。因此，本研究将为临床治疗神经系统常见疾病，如PD的诊断及治疗，提供有效而可靠的药物作用靶点。

1 材料与方法

1.1实验动物与试剂Sprague-Dawley(SD)大鼠40只，由锦州医科大学实验动物中心提供，体质量180～220 g，动物合格证号：SCXK(辽) 2007-0009。UCN(10-6mol·L-1)；Astressin(AST，CRF-2R的受体阻断剂，10-6mol·L-1)；DA 0.5 mol·L-1；Cropromazine(CPM，为DA受体的阻断剂，1.0 mol·L-1)；GLU(1.0 mol·L-1)；MK-801(NMDA受体的常用阻断剂，1.0 mol·L-1)；PKA及H-89，上述药品及试剂全部购自美国Sigma公司。

1.2麻醉开颅并对STN定位取40只上述SD大鼠，乌拉坦腹腔注射(1 g·kg-1)全麻，麻醉成功后，将大鼠置于脑立体定位仪，定位STN，常规开颅术开颅。根据Paxions & Watson大鼠脑图谱，确定STN的坐标：中线旁开2.5～3.0 mm，前囟后3.8～4.0 mm，脑表下7.0～8.0 mm。

1.3微电泳受试药物采用神经电生理学实验方法中的微电泳技术(51-217 型微管拉制仪，美国STOELTING公司)及神经元细胞外记录相结合的实验方法。拉制的7管玻璃微电极呈伞装，中心管直径为4～8 μm间，中心电阻在5～12 MΩ作用。含有1%滂胺天蓝的NaCl溶液(3.0 mol·L-1)灌注于中心管内，作为本实验用引导电极；另外6个外周管的电阻均应控制在20～100 MΩ之间，分别灌注下列受试药物，包括UCN、AST、DA、CPM、GLU以及MK-801。1.4生物肽UCN对STN神经元放电影响微电极推进器将玻璃微电极接近定位的STN坐标位置，然后缓慢插入STN， DAM80 微电极放大器采集STN神经元单位放电，经过滤波后，示波器上显示STN神经元放电波形，Spike2采集系统(英国CED公司)处理神经元输入的生物电信号。在本实验中，监测STN神经元自发放电情况，包括观察STN放电波形、STN神经元传出分布的方式及频率、是否有爆发式放电、放电的基本特征及形式。通过外周管分别微电泳不同的受试药物，包括微电泳不同浓度神经内分泌生物活性肽UCN及CRF-2R阻断剂AST，微电泳为电流40 nA，滞流的阻力电流为10 nA，微电泳时程20 s，记录UCN及CRF-2R阻断剂对STN 神经元放电影响。微电泳UCN过程中给予AST，监测UCN及CRF-2R之间的关系。

1.5生物肽UCN对STN内的DA能、GLU能神经传递的影响6个外周管实验前1 h灌注GLU及NMDA阻断剂MK-801，把GLU微电泳入STN神经元，观察STN 内的神经元自发放电的变化，于微电泳GLU的41～60 s，微电泳20 s UCN，于微电泳GLU的81～100 s之间微电泳AST，20 s。监测UCN对STN 内GLU能神经传递的影响。同上述方法，把DA及其受体阻断剂CPM微电泳入STN神经元，监测STN 神经元放电的变化，于微电泳DA的41～60 s、81～100 s之间，分别微电泳UCN和CRF-2R阻断剂AST 各20 s，监测UCN对STN 内DA 能神经传递的影响。最后，在微电泳CRF-2R阻断剂AST-2B、PKA及其阻断剂H-89，观察UCN对STN中神经元影响的可能信号机制。

2 结果

2.1STN神经元自发放电情况共定位并成功观察到STN神经元58个，观察受试STN神经元的放电波形及特征。STN神经元放电频率比较缓慢并且规则，大多为单个神经元放电，为单峰，未见双向动作电位(action potential, AP)，未见爆发式多棘放电。STN神经元放电频率一般在0～8 Hz之间。

2.2神经肽UCN及AST对STN神经元放电影响本部分实验中共观察STN神经元33个。将UCN(10-6mol·L-1, 20 nA，20 s)微电泳入受试的STN神经元，81.81%(27/33)STN神经元自发放电频率被降低，对18.19%(6/33)STN神经元无明显改变。上述33个被观察的STN神经元的平均放电频率由微电泳前的(3.65±0.27)Hz减少至(2.05±0.33)Hz，给予UCN前、后STN神经元放电频率降低，差异具有显著性(P<0.01)。此外，选择对UCN产生抑制作用的STN神经元24个，给予AST(10-6mol·L-1, 20 nA，20 s)，实验中发现79.17%(19/24)STN的放电频率被CRF-2R阻断剂AST明显升高，由(3.45±0.36)Hz升高至(5.55±0.47)Hz(P<0.01)。选取对UCN产生抑制效应的上述STN神经元中的20个，微电泳UCN(20 nA，40 s)过程中给予AST(20 nA，20 s)，实验中发现UCN的抑制效应被AST拮抗，差异具有显著性(P<0.01)，可翻转85%(17/20)STN神经元的抑制效应，频率由(2.11±0.34)Hz增加至(5.45±0.53)Hz。见Fig 1。

Fig 1 Effect of UCN on STN neuron’s spontaneous discharge

AST was used during the period of 21th-40th s in UCN.**P<0.01vsnormal group;##P<0.01vsUCN group.

2.3UCN及AST对STN中抑制性DA神经传递的影响在本部分实验中，观察了对DA产生抑制效应的STN神经元共计21个。发现DA(20 nA，20 s)可使正常的STN神经元产生抑制效应，拮抗STN神经元的正常自发放电波形及频率。STN放电频率由(3.45±0.55)Hz降低至(2.17±0.32)Hz，该实验数据差异具有显著性(P<0.01)。然后，选取上述对DA产生抑制效应的21个STN神经元，于微电泳DA 的21～40 s之间，外周管微电泳UCN(20 nA，20 s)，发现71.42%(15/21)STN中的DA神经元的放电频率进一步下降，放电频率由(2.17±0.32)Hz明显减少至(1.45±0.29)Hz，(P<0.05)。最后，在微电泳DA的61～80 s之间，由外周管同时微电泳AST(20 nA，20 s)，使原本抑制的76.19%(16/21)STN中DA神经元放电频率明显增加，放电频率由 (1.65±0.27)Hz增加至(4.52±0.68)Hz，该实验数据差异具有显著性(P<0.05)。见Fig 2。

Fig 2 Effects of UCN on DA-ergic neuron in STN

A: UCN affected DA-ergic neuron in STN. UCN and AST were used to observe the effects of UCN on DA; B: The effects and wave of UCN on STN’s DA-ergic neurons.**P<0.01vsnormal group;##P<0.01vsDA group.

2.4UCN及AST对STN中兴奋性GLU神经传递的影响在本部分实验中，观察对GLU产生兴奋效应的STN神经元共计18个。由外周管微电泳GLU(20n A，20 s)，77.78%(14/ 18)STN神经元产生兴奋效应，其自发放电频率明显加快，差异具有显著性(P<0.01)。然后，选择上述对GLU产生兴奋效应的14个STN神经元，在21～40 s之间由外周管微电泳UCN(20 nA，20 s)，STN中的78.57%(11/14)的GLU能放电频率明显减少(P<0.01)，放电频率由(5.67±0.48)Hz减少至(2.93±0.77)Hz。最后，选用对GLU产生兴奋效应的GLU能神经元14个，在微电泳GLU的61～80 s，于外周管微电泳CRF-2R阻断剂AST(20 nA，20 s)，AST可明显增加STN神经元放电频率(P<0.05)，放电频率由(5.65±0.38)Hz增加至(6.65±0.47)Hz，见Fig 3。

Fig 3 Effects of UCN on glu-ergic neuron in STN

A: UCN affected GLU-ergic neuron in STN. UCN could inhibit the excited effects of GLU and AST could excited GLU in STN; B: The effects and wave of UCN on STN’s GLU-ergic neurons.**P<0.01vsnormal group;#P<0.05,##P<0.01vsGLU group.

2.5UCN对STN神经元中CRF-2R及PKA通路的影响在本研究中，另选择对PKA产生作用的STN神经元16个，在提前给予PKA通路激动剂后，再给予UCN，UCN可阻断PKA产生的兴奋效应，在21～40 s之间由外周管微电泳UCN(20 nA，20 s)，STN中的75.0%(12/16)的GLU能放电频率明显减少(P<0.01)，放电频率由(4.29±0.37)Hz减少至(3.02±0.33)Hz。在微电泳PKA期间，于外周管微电泳H89(20 s)，PKA 的兴奋效应消失，而给予UCN，不能继续抑制STN神经的放电，放电频率由微电泳前的(3.06±0.34)Hz变化至(3.03±0.29)Hz。给予CRF-2R阻断剂AST(20 nA，20 s)，AST也不再增加STN神经元放电频率，放电频率变化为(3.07±0.33)Hz(P>0.05)。见Fig 4。

3 讨论

本实验结果表明，神经内分泌生物肽UCN可明显降低基底神经节中的STN神经元放电频率及波形，给药过程中未见爆发式放电，提示UCN抑制STN神经元的放电。然而，CRF-2R阻断剂AST明显加快STN神经元的放电频率，给予AST过程中偶见爆发式放电。另外，微电泳UCN期间同时微电泳AST，AST翻转UCN的抑制效应，实验结果进一步提示STN中存在UCN能神经元，并且UCN 与CRF-2R结合后触发随后的生物学效应，产生对STN的抑制作用。

Fig 4 Effects of UCN on PKA in STN

A: UCN affected CRF-2R and PKA in STN. During the period of PKA, administrated UCN, PKA and H89; B: The effects and wave of UCN on STN’s PKA and CRF-2R.**P<0.01vsnormal group;##P<0.01 vs PKA group.

本实验中的结果进一步证实，DA能在STN的神经传递中起抑制效应，而由外周管同时微电泳UCN，UCN协同了DA的抑制效应。相反，AST产生兴奋效应，拮抗DA的抑制效应。本实验结果提示，DA能与UCN在STN的神经元中存在交汇现象。 DA能与UCN都对STN放电产生抑制效应，进一步提示UCN可能在PD等病理情况下，对STN神经元起保护作用，并且这种保护作用是通过与CRF-2R结合而实现的。

本实验数据证实，GLU能神经投射纤维对STN神经元有明显的兴奋作用，神经生物肽UCN可以拮抗GLU的过度兴奋效应，且同时微电泳AST 对GLU兴奋效应具有一定协同作用，提示UCN及GLU能在STN中存在汇聚作用，UCN与STN神经元中CRF-2R结合后，拮抗STN中的GLU能神经元的过度兴奋毒性。本实验室既往研究发现，在PD病理情况下，DA能神经元在Bgl中的黑质(substantia nigra, SN)——STR通路中受损，这就使DA的抑制作用减弱，从而使具有兴奋效应的神经递质，如乙酰胆碱能(acetyl choline，ACH)及GLU能等相对占优势，导致PD的肌张力增强的临床表现[9-10]。本实验的结果表明，UCN可以降低GLU能的神经兴奋性，降低PD等病理状态下GLU过度表达所产生的兴奋毒性，提示UCN可在PD等疾病中发挥神经保护效应及治疗作用。

UCN2与CRF-2R 结合后是如何对STN神经元产生抑制效应的呢？UCN2可能在PD中发挥保护作用机制如何呢？在本实验研究的最后一部分对机制进行了初步研究。实验中发现，UCN能抑制PKA所引起的STN神经元的抑制效应，但UCN的抑制作用在给予PKA阻断剂后，该效应被取消，并且给予CRF-2R阻断剂后，也不再发挥作用，该实验结果提示，UCN很可能与CRF-2R 结合后，进而通过激活PKA而引起随后的生物学效应，阻断了神经递质的兴奋毒性作用有关。

UCN是CRF肽类家族的一个新型的神经内分泌生物肽，具有抗焦虑、抗糖尿病心肌病变、降血压、扩血管等多种生理及药理作用[11-12]。另外，本实验室既往已经证实，在脑损伤过程中UCN具有神经保护作用，UCN可抑制STR神经元的过度放电，特别是在大鼠吗啡成瘾中减轻大鼠的成瘾性，能明显改善阿片类药物的成瘾及戒断综合症[7, 13-14]，发挥抑制STR神经元过度放电的神经保护作用。但是，UCN是如何发挥其CNS的保护作用的呢？目前，其具体机制尚不明确[14]。在本实验中，证实UCN与CRF-2R 结合后，发挥抑制STN自发性放电的效应，可能是UCN发挥神经元的保护作用的初始机制，并进一步证实UCN与CRF-2R 结合后触发了PKA信号通路，这其中可能还涉及其他分子生物学机制，目前仍不明确，应在今后的研究中进一步阐述和证实。本实验结果表明，UCN通过与CRF-2R结合，进而通过激活PKA，抑制STN神经元放电活动，协同DA的抑制效应，降低STN神经元中GLU的过度兴奋性，UCN可能在生理及PD病理情况下发挥CNS保护作用。

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EffectsofneuroactivepeptideurocortinonSTNneuron’sspontaneousdischargeandrelationshipwithCRF-2R

TIAN Fei1, LIU Chun-na2, LIU Xin-yu2, CHEN Qiu-yuan2, DING Yu-hao2

(1.theSecondAffiliatedHospitalofShantouUniversity,ShantouGuangdong515041,China;2.DeptofPharmacology,JinzhouMedicalUniversity,JinzhouLiaoning121000,China)

AimTo investigate the effects of endocrinal petptide urocortin on subthalamic nucleus (STN) neuron’s discharge, also observe the convergence effect of UCN with dopamine (DA) and glutamate (GLU), so as to understand the regulation effects of UCN and its mechanism in Parkinson’s disease (PD).MethodsForty Sprague-Dawley rats were used in this experiment. Nerve electrophysiology method-microiontophoresis was used to observe the effects of UCN on STN neuron firing rates and firing wave. Astressin (AST, the blocker of CRF receptor 2), protein kinase A (PKA) were used to observe the effects of UCN whether via CRF-2R and PKA signal pathway. Moreover, given UCN during the period of DA and GLU, the effects of UCN on DA and GLU in STN neurons were determined.ResultsDuring the period of using the UCN, UCN could inhibit the firing rate of 82% (27/33) STN neuron (P<0.01), and the firing discharge rates were reduced from(3.65±0.27)Hz to (2.05±0.33) Hz (P<0.01). However, the inhibitory effects of UCN in STN could be antagonized by AST. Given UCN during the period of microiontophoresis of inhibitory neurotransmitter (DA) and excited neurotransmitter (GLU), UCN could enhance the effects of DA and attenuate the excitatory effects of GLU (P<0.01).ConclusionUCN and GLU/DA in STN, UCN play inhibitory and regulated effects on STN neurotransmitters(DA and GLU)via CRF-2 receptor and PKA signal pathway.

subthalamic nucleus; dopamine; glutamate; Parkinson’s disease; urocortin; microiontophoresis

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.10.019

A

：1001-1978(2017)10-1425-06

R-332；R322.81；R338.1；R338.24；R745.702.2；R977.6

时间：2017-9-5 9:26 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170905.0925.038.html

2017-05-20,

2017-08-25

广东省医学科学技术研究基金(No A2015085)；国家大学生创新基金 (No 201610160042)

田 飞(1977-)，男，硕士，副主任医师，研究方向：神经外科学，E-mail: 30377554@qq.com； 刘春娜(1977-)，女，博士，教授，硕士生导师，研究方向：神经药理学，通讯作者，Tel：0416-4673465，E-mail: 30377554@qq.com