Wnt/β-catenin信号通路调控哮喘气道重塑的机制研究*

贾宵宵， 郑榕颖， 黄 悦， 曾泽宇， 张维溪

(温州医科大学附属第二医院，育英儿童医院儿童变态反应(过敏)与免疫科， 浙江 温州 325027)

Wnt/β-catenin信号通路调控哮喘气道重塑的机制研究*

贾宵宵， 郑榕颖， 黄 悦， 曾泽宇， 张维溪△

(温州医科大学附属第二医院，育英儿童医院儿童变态反应(过敏)与免疫科， 浙江 温州 325027)

目的： 探讨Wnt/β-catenin 信号通路调控哮喘气道平滑肌细胞(ASMC)的功能和参与哮喘气道重塑的机制。方法: 建立大鼠哮喘模型，提取大鼠ASMC。Western blot法检测哮喘组和正常组大鼠ASMC中β-连环蛋白(β-catenin)、糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)、原癌基因c-Myc和细胞周期蛋白D1(cyclin D1)的蛋白表达。抑制哮喘组和对照组ASMC中β-catenin和转录辅助因子p300/CBP间的相互作用后，采用CCK-8法和流式细胞术检测ASMC的细胞活力和周期变化。抑制P38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)活性后，采用Western blot法检测c-Myc和cyclin D1的蛋白表达变化。结果: Western blot法显示哮喘组ASMC中β-catenin、c-Myc和cyclin D1的蛋白表达水平均明显高于对照组(P<0.05)， 同时GSK-3β的蛋白表达水平则低于对照组(P<0.05)。抑制β-catenin和p300/CBP间相互作用后，哮喘组ASMC的细胞活力下降幅度和细胞周期改变程度均较对照组更为明显(P<0.05)。抑制P38 MAPK活性后，哮喘模型大鼠及对照大鼠ASMC中Wnt/β-catenin信号通路的靶蛋白c-Myc 和cyclin D1的表达均下调，差异有统计学意义(P<0.05)。结论: Wnt/β-catenin信号通路可能通过上调c-Myc和cyclin D1的表达、 与P38 MAPK信号通路相互作用以及调控ASMC的生长和分化等途径，影响ASMC的功能，参与哮喘气道重塑。

哮喘； 气道重塑； 气道平滑肌细胞； Wnt/β-catenin信号通路； β-连环蛋白

支气管哮喘(简称哮喘)是一种由多种细胞和细胞因子参与，以慢性气道炎症为特征的异质性疾病[1]。气道重塑是哮喘最主要的病理生理特征，其形成机制十分复杂，目前的研究表明，气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cell，ASMC)的增殖和迁移是导致气道重塑发生和发展的关键因素[2]。Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路与哮喘的关系十分密切[3]，对ASMC的增殖和分化功能亦有影响[4-5]。糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β)调控β-catenin在细胞内的表达，而核内原癌基因c-Myc和细胞周期蛋白D1(cyclinD1)均为Wnt/β-catenin信号通路下游的靶基因，已被证明参与哮喘气道重塑过程[6-7]。 因此，Wnt/β-catenin信号通路可能通过调节其下游靶基因的表达水平和影响ASMC的增殖和分化功能等途径，参与哮喘气道重塑的形成和发展。此外，细胞内的信号转导途径并非单独孤立的存在，事实上各信号通路间存在着功能上的关联，目前的研究表明，Wnt/β-catenin和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路间存在着大量的相互串话[8]，但Wnt/β-catenin和MAPK信号通路是否共同调控哮喘气道重塑过程，目前尚未完全阐明。

本研究通过建立慢性哮喘模型大鼠，获取大鼠AMSC，研究Wnt/β-catenin 信号通路在哮喘气道重塑过程中对ASMC功能的调控，探讨Wnt/β-catenin 信号通路参与哮喘气道重塑的具体机制。

材料和方法

1实验材料

1.1实验动物 选用SPF级雄性SD大鼠16只，年龄为8周，体重180～200 g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，许可证编号为SCXK(沪)2012-0002，饲养于温州医科大学实验动物中心SPF级实验室。

1.2主要试剂 澳洲胎牛血清、DMEM高糖培养基、0.25%胰蛋白酶、0.02%EDTA溶液及链、青霉素等购自Thermo Fisher Scientific；兔抗大鼠α-actin单克隆抗体、兔抗大鼠c-Myc单克隆抗体和兔抗大鼠cyclin D1单克隆抗体购自Abcam；免疫组化 II 抗试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；P38 MAPK信号通路抑制剂SB203580、β-catenin/CBP特异性抑制剂ICG-001和β-catenin/p300特异性抑制剂IQ1均购自Selleck Chemicals； CCK-8试剂盒购自Dojindo；细胞周期检测试剂盒购自BD Biosciences；卵清蛋白(ovalbumin，OVA)购自Sigma。

2实验方法

2.1动物模型的建立 参照课题组既往成功建立模型的方法复制慢性哮喘气道重塑模型[9-10]。实验动物分别分成哮喘组和对照组。模型建立过程分为致敏和激发2个阶段，共10周。致敏阶段共2周，分别在第1天、第8天给哮喘组大鼠腹腔注射OVA/Al(OH)3混合液1.5 mL [内含OVA 1 mg，Al(OH)3100 mg]，相应给予对照组大鼠腹腔注射生理盐水1.5 mL。从第3周第 1天开始，隔天使用超声雾化器向处于密闭塑料箱内的哮喘组大鼠用1% OVA生理盐水溶液进行雾化，每次30 min，共持续8周，对照组大鼠予生理盐水替代进行雾化。

2.2ASMC和肺组织的提取 末次雾化后16～24 h内用10%水合氯醛(4 mL/kg)腹腔注射处死大鼠，在超净台上获取大鼠气管、支气管。在显微镜下操作，剪取一小块肺叶，浸入4%多聚甲醛予以固定，用于苏木精-伊红(HE)染色观察肺组织病理结构。继续剔除粘附在气管上的剩余肺组织、支气管血管和脂肪组织等，纵向剖开气管、支气管，轻轻刮除外膜及内膜，将气管段剪成1 mm3或更小组织块。使用胶原酶-胰酶混合消化法去除上皮细胞和成纤维细胞等杂质，获取纯度较高的ASMC后进行传代培养，取第3～6代ASMC进行实验。

2.3肺组织HE染色 将固定后的肺组织常规石蜡包埋，切片(4 μm)，行HE染色后观察肺组织病理结构。

2.4ASMC的鉴定 在倒置相差显微镜下观察细胞形态并拍摄照片。将贴壁的ASMC消化制作成细胞悬液，接种至无菌细胞爬片上并置于12孔板中，待细胞生长汇聚至70%～80%左右，倒去培养液，使用PBS洗涤细胞3次，每次5 min。4%多聚甲醛固定15 min，再经过洗涤、封闭等步骤后，滴加稀释的α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)Ⅰ抗(1:100)4 ℃孵育过夜。然后使用相应的 II 抗(1:100)室温孵育细胞1 h，经清洗、染色等步骤后镜检。

2.5CCK-8实验检测细胞活力 从哮喘组和对照组大鼠获取的ASMC分别进行分组处理：①阴性对照(negative control，NC)组：正常培养的细胞不加任何处理；(2)DMSO组：细胞培养液中添加0.5%的DMSO，检测0.5‰浓度DMSO是否影响细胞活力；(3)β-catenin/CBP抑制剂ICG-001组：2种ASMC用特异性抑制剂ICG-001在100 μmol/L、50 μmol/L、25 μmol/L和5 μmol/L浓度作用下培养24 h；(4)β-catenin/p300抑制剂IQ1组：2种ASMC用特异性抑制剂IQ1在100 μmol/L、50 μmol/L、25 μmol/L和5 μmol/L浓度作用下培养24 h。2种抑制剂ICG-001和IQ皆使用DMSO溶解，并且根据各处理组条件，分别配置相应浓度的药物，最终使各处理组培养液中DMSO浓度固定为0.5‰。每个处理组设6个复孔，去除最大值和最小值后，取平均值作为最终实验结果，每组实验重复3次。

用0.25%胰蛋白酶消化贴壁培养的哮喘组和对照组ASMC，以含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基制成单细胞悬液，将各组ASMC以1×108/L浓度接种于96孔板内，每孔100 μL体积，置于恒温培养箱内(37 ℃、5% CO2)培养1 d左右。待细胞生长汇聚至50%～60%左右时，换无血清DMEM培养基培养细胞24 h，使所有细胞处于相同生长状态。然后对上述分组的细胞进行药物干预。药物影响下培养细胞24 h后，吸弃培养基，PBS洗板2次，重新加入含10% CCK-8试剂的培养液，避光37 ℃下作用2 h，使用多功能酶标仪在450 nm下检测各孔细胞的吸光度(A)值，根据公式计算结果，判断各组细胞的生长情况，以无处理的阴性对照组细胞活力为100%。

2.6流式细胞术检测细胞周期的分布 哮喘组和对照组ASMC各自分为(1)NC组：正常培养的细胞不添加任何处理；(2)ICG-001组：使用50 μmol/L ICG-001培养ASMC 24 h；(3)IQ1组：使用50 μmol/L IQ1培养ASMC 24 h。

使用0.25%胰蛋白酶消化贴壁的各组ASMC，制成单细胞悬液后分别收集细胞至各15 mL离心管，离心收集细胞；用预冷的PBS吹打洗涤细胞， 1 000 r/min离心5 min后弃上清，重复1次；加入预冷70%乙醇，于4 ℃固定过夜(18 h以上)；离心收集固定后的细胞， PBS洗涤细胞1次，再次离心5 min，弃上清；每个样品加入500 μL细胞周期检测试剂碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色，室温避光孵育20 min；以流式细胞仪标准程序检测细胞，计数2～3万个细胞，结果用细胞周期拟和软件分析。

2.7Western blot法检测c-Myc、GSK-3β、β-catenin和cyclin D1蛋白水平的变化 将长满正常对照组和哮喘组平滑肌细胞的培养皿置于冰上，使用预冷的PBS清洗细胞3次，加入细胞裂解液RIPA，裂解30 min后，用细胞刮刮脱细胞，收集液体至EP管，超声裂解5秒、3次，将EP管移至高速离心机中，4 ℃ 12 000 r/min离心20 min，取上清液。使用BCA试剂盒测定蛋白浓度，配置成等体积等浓度的蛋白体系，采用8% SDS-PAGE分离蛋白、300 mA恒流转膜以及5%脱脂牛奶室温封闭2 h后，加入相应单克隆 I 抗4 ℃孵育过夜。16～18 h后将膜浸入TBST中，置于摇床上漂洗3次，加入 II 抗孵育2 h，TBST洗涤后进行化学发光、显色、显影。

3统计学处理

实验数据经SPSS 22.0统计软件进行分析，计量资料采用均数±标准(mean±SD)表示；均数间差异比较采用独立样本t检验；两变量之间的相关性分析采用直线相关分析法。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1动物一般情况观察

与对照组大鼠比较，哮喘组大鼠雾化激发后明显更为烦躁不安、易激惹，出现抓耳挠腮、呼吸加深加快、腹肌痉挛等症状，雾化结束后大鼠多呈俯伏不动的姿态，密封雾化箱内的大小便排泄物明显较对照组大鼠增多。对照组大鼠在用生理盐水雾化过程中仍活动自如，无明显异常表现。经过多次激发之后，哮喘组大鼠相较对照组毛色苍黄、无光泽。

2肺组织病理学改变

正常对照组大鼠肺组织HE染色显示正常小气道和肺泡结构完整，黏膜上皮完整，支气管管腔规则，支气管、血管周围未见炎性细胞的浸润。哮喘组大鼠肺组织HE染色显示气道壁明显增厚，基底膜不规则增厚，黏膜褶皱增多，可见黏液腺增生、黏液栓形成和黏膜下水肿，管腔内可见渗出物和炎性细胞增多，支气管黏膜下、支气管和血管周围可见嗜酸性细胞、中性粒细胞和淋巴细胞等炎症细胞的广泛浸润(图1)。综合肺组织切片HE染色结果，表明本实验大鼠哮喘气道重塑模型成功建立。

Figure 1. HE-stained lung tissues from the rat (×400).

图1大鼠肺组织HE染色

3大鼠ASMC的鉴定

于倒置相差显微镜下观察分离培养的细胞形态，镜下可见单个平滑肌细胞呈梭形或不规则三角形, 有多个细胞突起, 胞质丰富, 密度高, 核圆形居中, 有多个核仁。细胞生长致密时平行排列成束, 部分重叠, 表现为典型的“谷峰”形态。对ASMC使用SP法进行特异的α-SMA免疫细胞化学染色后，99%以上细胞呈强阳性染色，胞浆呈棕黄色或棕红色，证实为ASMC，见图2、3。

Figure 2. Images of ASMC under microscope observation (×100).

图2静置培养后ASMC的形态观察

Figure 3. The identification of ASMC by α-SMA stainning (×100).

图3ASMC的培养鉴定

4Wnt/β-catenin信号通路对ASMC生长的调控

4.1细胞活力的变化 0.5‰浓度的DMSO对细胞活力无明显抑制。对哮喘组和正常组ASMC使用β-catenin/CBP特异性抑制剂ICG-001和β-catenin/p300特异性抑制剂IQ1干预培养细胞24 h，抑制β-catenin和p300或CBP间的相互作用，结果显示ICG-001在4个浓度(5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L)均抑制哮喘组ASMC的细胞活力(P<0.01)，但在5 μmol/L浓度时对正常组ASMC的活力无明显抑制作用。对比各浓度ICG-001对哮喘组和正常组ASMC活力影响，发现相同处理条件下哮喘组ASMC的活力明显低于正常组ASMC，差异具有统计学显著性(P<0.05)，见图4。

另一方面，IQ1浓度在5 μmol/L 、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L时，均对哮喘组ASMC的细胞活力有明显抑制(P<0.01)，但在浓度为5 μmol/L 、25 μmol/L时对正常组ASMC的活力无明显抑制作用。相同IQ1浓度作用时，各哮喘组ASMC的活力明显低于正常组ASMC，差异均具有统计学显著性(P<0.05)，见图5。

Figure 4. The cell activity of the ICG-001 treated ASMC in asthma group and control group. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsNC group;#P<0.05,##P<0.01vscontrol group.

图4使用ICG-001干预24h后ASMC的细胞活力变化

Figure 5. The cell activity of the ASMC in IQ1 treated asthma group and control group. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsNC group；#P<0.05vscontrol group.

图5使用IQ1干预后ASMC的活力变化

4.2细胞周期分布的变化 使用50 μmol/LICG-001和IQ1干预培养正常对照组ASMC后，与NC组相比，各处理组ASMC 的G0/G1期占细胞周期百分比有所上升，S期少许下降，但差异均无统计学显著性，见图6。而使用抑制剂处理的哮喘组ASMC，与NC组比较，各处理组ASMC 的G0/G1期延长，S期和G2/M期占细胞周期的百分比均明显下降，差异均具有统计学显著性(P<0.05)，见图7。

5ASMC中β-catenin、GSK-3β、c-Myc和cyclinD1蛋白表达量的变化

检测2组ASMC中β-catenin、GSK-3β、c-Myc和cyclin D1蛋白表达量的变化，结果显示哮喘组ASMC中的β-catenin、c-Myc、cyclin D1蛋白的相对灰度值均高于正常对照ASMC，差异有统计学显著性(P<0.05)。哮喘组ASMC中GSK-3β蛋白的相对灰度值低于对照组ASMC，差异有统计学显著性(P<0.05)，见图8、表1。

Figure 6. The change of cell cycle distribution in ICG-001 or IQ1 treated ASMC of control rats. Mean±SD.n=3.

图6正常组ASMC经2种抑制剂处理后细胞周期的变化

Figure 7. The change of cell cycle distribution in ICG-001 or IQ1 treated ASMC of asthma rats. Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01vsNC group.

图7哮喘组ASMC经2种抑制剂处理后细胞周期的变化

6抑制P38MAPK信号通路后c-Myc、cyclinD1蛋白表达量变化

使用特异性P38 MAPK信号通路抑制剂SB2023580干预培养哮喘大鼠ASMC 24 h后，位于Wnt/β-catenin信号通路下游的c-Myc和cyclin D1蛋白表达量与对照组ASMC相比均明显下降，差异具有统计学显著性(P<0.01)，见图9、表2。

Figure 8. The protein expressions of β-catenin,GSK-3β, c-Myc and cyclin D1 in the ASMC.

图8β-catenin、GSK-3β、c-Myc和cyclinD1的蛋白表达

表1GSK-3β、β-catenin、c-Myc和cyclinD1的蛋白表达

Table 1. The protein expressions of β-catenin, GSK-3β, c-Myc and cyclin D1 in the ASMC (Mean±SD.n=8)

Groupβ-cateninGSK-3βc-MycCyclinD1Control0.27±0.060.75±0.330.25±0.110.17±0.03Asthma0.49±0.16*0.30±0.08*0.44±0.04**0.65±0.12**

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

Figure 9. The protein expressions of cyclin D1 and c-Myc in the ASMC of asthma rats.

图9c-Myc和cyclinD1蛋白在ASMC中的表达

表2c-Myc和cyclinD1蛋白在ASMC中的表达

Table 2. The protein expressions of c-Myc and cyclin D1 in ASMC of asthma rats (Mean±SD.n=8)

Groupc-MycCyclinD1NC0.49±0.130.72±0.16SB2035800.08±0.04**0.29±0.07**

**P<0.01vsNC group.

讨 论

气道重塑是哮喘最主要的病理生理特征，表现为ASMC肥大增生、气道上皮纤维化、气道壁增厚、管腔面积缩窄、黏膜下新血管形成、黏液腺体肥厚增生和炎症细胞浸润等[11-12]。ASMC是主动参与哮喘炎症过程的效应细胞，它通过与其它炎症细胞的相互作用，改变自身收缩性能，分泌各种炎症介质、细胞因子和细胞外基质蛋白等各种方式，参与哮喘气道重塑[2]。同时，平滑肌细胞的增殖伴有细胞核内β-catenin蛋白含量增加以及β-catenin mRNA增多，β-catenin还参与ASMC的有丝分裂过程，其在胞内聚集和核内转移对维持ASMC的生长具有重要作用，可参与调控ASMC分泌细胞外基质的过程[4-5]。考虑到β-catenin与ASMC的功能关系十分密切，两者同时又和哮喘气道重塑的形成具有相关性，因此我们开展此研究，旨在探讨Wnt/β-catenin信号通路对ASMC的相关功能的调控作用及参与哮喘气道重塑的机制。

1Wnt/β-catenin信号通路对哮喘ASMC生长的调控

CBP和p300是组蛋白乙酰转移酶中一种重要的大分子蛋白，其结构存在高度的同源性，因而时常被合称为p300/CBP，它们能调节许多转录因子，介导转录激活，同时还参与细胞内的一系列生物活性调节,如细胞周期调节、分化、细胞凋亡和DNA损伤修复等[13-14]。已有研究表明，Wnt/β-catenin信号通路上存在着p300/CBP的作用位点，并且β-catenin/CBP和β-catenin/p300影响细胞的增殖和分化功能[4, 15]。

我们的研究发现，阻断CBP及p300两个位点与β-catenin间的相互作用后，ASMC的活力明显降低，并且相同处理条件下，哮喘组ASMC的活力下降幅度明显大于正常组，表明Wnt/β-catenin可能通过调控ASMC的生长，参与哮喘气道重塑。

2Wnt/β-catenin信号通路激活使下游靶基因表达上升

原癌基因c-myc和cyclin D1是Wnt/β-catenin信号通路的下游靶基因，与哮喘气道重塑的形成表现出一定的相关性，课题组既往的研究亦表明，β-catenin和c-Myc参与哮喘气道重塑的形成[6]。

本研究中，我们使用Western blot法检测哮喘组以及正常对照组ASMC中Wnt/β-catenin通路的核心转录因子β-catenin及其通路下游的靶基因c-Myc和cyclin D1的表达变化，结果显示哮喘组ASMC中β-catenin表达上升，而对β-catenin的表达有抑制作用的GSK-3β则表达下降，表明哮喘气道重塑大鼠ASMC中存在Wnt信号通路的激活。提示Wnt/β-catenin信号通路的激活可能通过上调c-Myc和cyclin D1的表达，影响平滑肌细胞的相关功能，从而参与气道重塑过程。

3Wnt/β-catenin信号通路通过与MAPK信号通路间的相互作用

MAPK信号通路被证明可能参与哮喘气道重塑中ASMC的增殖过程[16]，MAPK还可以通过磷酸化导致GSK-3β的抑制，引发β-catenin在胞质内积累，引起Wnt相关敏感基因的表达[17]。多项研究报道[8, 17-18]Wnt信号家族可以激活p38 MAPK通路，表明p38 MAPK信号通路与Wnt信号通路关系密切，然而两者是否通过相互作用共同参与哮喘气道重塑过程以及其在ASMC中作用的具体机制尚未清楚。

我们的研究显示，使用特异性抑制剂SB203580抑制哮喘大鼠ASMC中p38 MAPK活性后，Wnt信号通路下游的c-Myc和cyclin D1表达量下降，提示p38 MAPK信号通路可以调节c-Myc和cyclin D1的蛋白表达，表明MAPK信号通路很可能通过与Wnt/β-catenin信号通路间相互作用共同影响ASMC功能，参与哮喘气道重塑。

综上所述，本研究通过建立大鼠慢性哮喘模型，获取大鼠ASMC，探究Wnt/β-catenin信号通路参与哮喘气道重塑的相关机制，结果提示Wnt/β-catenin信号通路可能通过上调c-Myc和cyclin D1的表达，与MAPK信号通路相互作用和调控ASMC的增殖与分化等途径，影响ASMC功能，参与哮喘气道重塑。

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(责任编辑： 林白霜， 余小慧)

Effects of Wnt/β-catenin signal pathway on asthma airway remodeling

JIA Xiao-xiao, ZHENG Rong-ying, HUANG Yue, ZENG Ze-yu, ZHANG Wei-xi

(Department of Pediatric Allergy and Immunology, The Second Affiliated Hospital and Yuying Children’s Hospital, Wenzhou Medical University, Wenzhou 325027, China. E-mail: zhangweixi112@163.com)

AIM: To explore the effect of Wnt/β-catenin signaling pathway in airway smooth muscle cells (ASMC) on asthmatic airway remodeling.METHODS: The asthmatic airway remodeling model in rats was established and the ASMC was isolated and cultured. The protein expression of β-catenin, glycogen synthase kinase-3β (GSK-3β), c-Myc and cyclin D1 in the ASMC was determined by Western blot. After depressing the interaction between β-catenin and p300/CBP, the cell activity was measured by CCK-8 assay and the change of cell cycle distribution was analyzed by flow cytometry. Meanwhile, the protein expression of c-Myc and cyclin D1 in the ASMC was determined by Western blot after inhibiting P38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) activity.RESULTS: The protein levels of β-catenin， c-Myc and cyclin D1 were significantly increased in asthma group while the protein level of GSK-3β was decreased in the same group (P<0.05). After depressing the interaction between β-catenin and p300/CBP, the cell activity of ASMC was decreased in asthma group compared with control group (P<0.05), and the change of the cell cycle distribution in asthma group was also more obvious (P<0.05). After inhibiting P38 MAPK activity, the protein levels of c-Myc and cyclin D1 were all decreased compared with control group in ASMC asthma and control rats (P<0.05).CONCLUSION: Wnt/β-catenin signaling pathway may participates in airway remodeling in asthma by increasing the protein expression of c-Myc and cyclin D1, reacting with the P38 MAPK signaling pathway and regulating the growth of ASMC.

Asthma; Airway remodeling; Airway smooth muscle cells; Wnt/β-catenin signaling pathway; β-catenin

1000- 4718(2017)09- 1683- 07

2017- 03- 07 [

] 2017- 05- 09

浙江省自然科学基金项目(No. LY15H010006)；浙江省科技厅项目(No. 2016C33182)；浙江省卫生高层次创新人才项目

R562.25

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.09.024

△通讯作者 Tel: 0577-88002125; E-mail: zhangweixi112@163.com