反义锁核酸封闭c-myc第二外显子翻译起始区对肝癌细胞凋亡的影响*

邓益斌， 肖树荣， 许桂丹， 黄赞松

(右江民族医学院附属医院医学检验中心，广西 百色 533000)

反义锁核酸封闭c-myc第二外显子翻译起始区对肝癌细胞凋亡的影响*

邓益斌， 肖树荣， 许桂丹， 黄赞松△

(右江民族医学院附属医院医学检验中心，广西 百色 533000)

目的： 探讨针对c-myc第二外显子翻译起始区的反义锁核酸对肝癌细胞活力和凋亡的影响。方法: 设计合成能特异性封闭c-myc基因第二外显子翻译起始区的反义寡核苷酸、硫代寡核苷酸和锁核酸，分别以阳离子脂质体介导转染HepG2细胞，采用RT-PCR检测细胞内c-Myc的mRNA表达变化；Western blot检测细胞内c-Myc的蛋白表达变化；流式细胞技术检测细胞凋亡情况；MTT法检测反义锁核酸的细胞毒性作用。结果: 转染第5天后，反义锁核酸组c-Myc的mRNA相对表达量为0.335±0.016，明显低于对照组(P<0.05)；c-Myc蛋白相对表达量为0.448±0.037，也明显低于对照组(P<0.01)；凋亡细胞比例为32%±6%，显著高于对照组(P<0.05)。结论: 针对c-myc第二外显子翻译起始区的反义锁核酸能有效促进肝癌细胞的凋亡。

肝细胞癌；c-myc基因； 反义锁核酸

原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是常见的恶性肿瘤之一，占我国肝癌的90%以上，严重威胁着人类的生命健康，自20世纪90年代起，我国肝癌死亡率上升为肿瘤的第2位。c-myc是细胞原癌基因之一，与肿瘤的发生发展关系密切，位于人类染色体8q24区，由3个外显子和2个内含子组成，其中第1外显子无编码序列，只起调控作用，第2、3外显子共同编码包含439个氨基酸残基的蛋白质，该蛋白主要与Max形成异二聚体后再与DNA核心序列结合，调控基因转录与表达[1-3]。据此推测，针对c-myc第二外显子翻译起始区设计合成反义锁核酸有可能会影响c-Myc的mRNA及蛋白的表达，通过影响肿瘤细胞增殖和凋亡发挥抗肿瘤作用。因此，在前期研究基础上[4-7]，我们进一步设计合成能特异性封闭c-myc基因第二外显子翻译起始区的反义锁核酸(antisense locked nucleic acid，anti-LNA)，以阳离子脂质体介导转染HepG2细胞，观察其对c-Myc的mRNA及蛋白表达的影响，以期为抗肝癌基因治疗寻找一种新型分子药物。

材料和方法

1细胞系

HepG2肝癌细胞株由中国人民解放军广州军区空军医院刘光泽博士惠赠，常规培养于含G418和10%胎牛血清的DMEM培养基中，37 ℃、5% CO2条件下5～6 d传代1次。

2主要试剂与仪器

DMEM培养基和G418(Gibco)；胎牛血清(杭州四季青公司)；LipofectamineTM2000(Invitrogen)；RNA抽提试剂盒(Sangon)；寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸、禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶、RNA酶抑制剂、Taq酶、缓冲液、三磷酸脱氧核苷酸等(TaKaRa)；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(南京凯基生物公司)；BCA蛋白定量试剂盒、十二烷基硫酸钠(SDS)、硝酸纤维膜、ECL发光液等(Sigma)。实时定量PCR仪(ABI)；FACS AriaTM流式细胞分析仪(BD)；半干电转系统(Bio-Rad)。

3方法

3.1反义LNA设计与合成 根据反义寡核苷酸作用原理及设计原则，利用RNAstructure 5.0软件设计并筛选出一条总自由能最低的互补于c-myc第2外显子翻译起始区(368～390 nt)的寡核苷酸片段，修饰如下：(1)LNA：5′-TGA△AGCT△ACCGT△ACT△ACGA△C-3′；(2)硫代寡核苷酸：5′-TGA#AGCT#ACCGT#ACT#ACGA#C-3′；(3)未修饰寡核苷酸：5′-TGAAGCTACCGTACTACGAC-3′；(4)无关序列：5′-CGCTATGTAATGCGCTATGG-3′。其中，△代表LNA修饰，#代表硫代修饰。各序列经BLAST排除与人同源后由GeneLink合成修饰并纯化。

3.2实验设计与脂质体转染 实验设对照组和实验组。对照组为空白对照(blank)组。实验组包括未修饰寡核苷酸(oligodeoxynucleotide，ODN)组、硫代寡核苷酸(phosphorothioate oligodeoxynucleotide，S-ODN)组和anti-LNA组。将HepG2细胞按1×108/L接种于16孔培养板，每孔100 μL，共设6个组，每组各设6个复孔，待细胞贴壁后，分别在各组每孔中加入含LNA(或寡核苷酸)的脂质体-DMEM混合液1 mL，培养后第5天收集细胞进行mRNA、蛋白等指标检测。转染按脂质体说明书操作。

3.3c-Myc的mRNA检测 (1)RNA提取：于细胞收集管中加入RNA抽提试剂1 mL，迅速置于冰上，加入0.2 mL氯仿，室温静置15 min，4 ℃ 12 000 r/min离心15 min；取上清液，加入0.5 mL异丙醇，室温静置10 min，4 ℃ 12 000 r/min离心10 min；弃上清液，加入75%焦碳酸二乙酯乙醇溶液1 mL，4 ℃ 7 500 r/min离心5 min；弃上清液室温干燥5 min，溶于焦碳酸二乙酯无菌水中。(2)RNA逆转录：根据目的基因片段碱基序列利用软件设计并评价引物，交由上海英骏生物技术有限公司合成纯化。在微反应管中配制模板RNA和引物(各组均取上下游引物)混合液，总体积为12 μL。65 ℃ 5 min后，冰上迅速冷却。加入2×PCR预反应液8 μL，轻轻混匀，室温静置10 min，移入42 ℃恒温箱中保温60 min后，升至70 ℃保温10 min，移到冰中冷却2 min。(3)cDNA扩增：上述反应管移入PCR扩增仪中(上游引物为5′-TCAACGTTAGCTTCACCAAC-3′，下游引物为5′-TGGGCGAGCTGCTGTCGT-3′，产物长度为245 bp)。反应条件为94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35个循环；72 ℃ 10 min。取PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，并与内参照β-actin(550 bp)电泳条带比较，计算相对灰度比值。

3.4c-Myc蛋白的检测 收集细胞弃上清，用RIPA细胞裂解液[0.01 mol/L Tris-HCl (pH 7.5)，0.15 mol/L NaCl，1% Triton X-100，0.1% SDS (pH 7.4)，临用前加入PMSF 100 mmol/L]重悬，转入Eppendorf管，冰上静置1 h，4 ℃ 12 000 r/min离心15 min。取上清于新Eppendorf管，提取总蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒定量，于-70 ℃保存。取30 μg蛋白质样品与缓冲液[100 mmol/L Tris-HCl (pH 6.8)，200 mmol/L DTT，4% SDS，0.2%溴酚蓝，20%甘油]混合煮沸5 min,变性后点样于预先制备好的12% SDS-PAGE电泳胶板上，30～40 mA电泳，当溴酚蓝到达胶板底部时停止电泳。取预处理过的2张3 mm滤纸和1张硝酸纤维膜，按滤纸、凝胶、硝酸纤维膜、滤纸的顺序放入半干电转仪的正极板上，接好负极板后，10～12 V电转30 min。采用ECL发光液试剂盒进行检测，并利用凝胶图像分析系统曝光、拍照和定量分析。

3.5HepG2细胞凋亡的检测 采用Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞技术检测HepG2细胞凋亡情况。根据双变量流式细胞仪的散点图来判断结果:左上象限(Q1)为损伤细胞,右上象限(Q2)为坏死细胞,左下象限(Q3)为活细胞,右下象限(Q4)为凋亡细胞。严格按试剂盒说明书和仪器说明书操作。

3.6反义LNA的细胞毒性的检测 采用MTT比色法检测反义LNA对细胞活性的影响。采用含10%胎牛血清培养液配制单细胞悬液，以每孔1×104个细胞接种于96孔板，每孔200 μL，培养5 d后，每孔加MTT溶液(5 g/L，pH 7.4)200 μL，孵育4 h后，终止培养，吸弃培养上清液。每孔加入150 μL DMSO，振荡10 min，使结晶物充分溶解。酶联免疫监测仪上于490 nm波长处测定各孔吸光度(A)值。

4统计学处理

用SPSS 19.0统计软件进行数据处理和分析，所有数据采用均数±标准差(mean±SD)表示。各组间比较采用重复测量方差分析的SNK-q检验和Kruskal Wallis H检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1反义LNA对c-MycmRNA表达的抑制作用

与对照组相比，硫代寡核苷酸组和反义锁核酸组肝细胞中c-Myc的mRNA表达量均明显下调，其中反义锁核酸组下调尤为明显(P<0.05)，见图1。

Figure 1. The relative mRNA expression of c-Myc in the HepG2 cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsblank group;#P<0.05vsanti-LNA group.

图1各组肝癌细胞c-Myc的mRNA相对表达量

2反义LNA对c-Myc蛋白表达的抑制作用

与对照组相比，反义锁核酸组肝细胞中c-Myc蛋白相对表达量明显下降(P<0.01)，见图2。

3反义LNA对HepG2细胞凋亡的影响

采用Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞技术检测HepG2细胞凋亡情况。结果发现转染第5天后，硫代寡核苷酸组和反义锁核酸组的凋亡细胞比例均显著高于对照组(P<0.05)，反义锁核酸组的凋亡细胞比例更高一些，见图3。

Figure 2. c-Myc protein expression level in HepG2 cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsblank group;#P<0.05vsAnti-LNA group.

图2各组肝细胞c-Myc蛋白表达水平

Figure 3. The apoptotic rate of HepG2 cells induced by anti-LNA. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsblank group;#P<0.05vsanti-LNA group.

图3各组肝癌细胞的凋亡情况

4反义LNA对细胞的毒性作用

用药5 d后，采用MTT比色法测定各组A值，未修饰寡核苷酸组、硫代寡核苷酸组和反义锁核酸组的A值分别为1.18±0.05、1.16±0.04和1.15±0.05，与空白对照组(1.39±0.04)比较差异均无统计学意义，见图4。

Figure 4. The absorbance values of the HepG2 cells. Mean±SD.n=6.

图4各组肝癌细胞吸光度值

讨 论

目前认为，肿瘤细胞的恶性转化是一个由多细胞信号转导通路异常活化，使多种癌基因或抑癌基因表达异常，进一步促进癌症细胞异常增殖的多环节、多阶段、多步骤的复杂过程，而癌基因突变则是肿瘤细胞增殖的分子基础[8]。常见的癌基因有c-myc(增殖相关基因)、N-ras(转化基因)等，其中c-myc是新近研究发现的与肝细胞癌变密切相关的癌基因，是myc基因家族的重要成员之一，其编码蛋白属于核内转录因子，介导细胞生物信号转导，在细胞凋亡与增殖调控中发挥重要作用[9-11]。因而推测，封闭c-myc第二外显子翻译起始区的基因表达有可能会影响c-Myc mRNA及蛋白的表达，进而可能会影响肿瘤细胞凋亡，从而发挥抗肿瘤作用。

本研究利用计算机辅助药物设计软件设计合成能特异性封闭c-myc基因第二外显子翻译起始区的反义锁核酸片段，以阳离子脂质体介导转染HepG2细胞，利用逆转录聚合酶链反应、Western blot等分子生物学技术检测细胞内c-Myc的mRNA及蛋白表达情况，评估反义锁核酸的抗病毒效果。结果发现，反义锁核酸作用 5 d后，c-Myc的mRNA及蛋白质表达均较对照组明显下降，且细胞凋亡较对照组明显增多。因此认为，针对c-myc基因第二外显子翻译起始区的反义锁核酸可有效干扰c-myc基因的表达，进而促进肝癌细胞凋亡。

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(责任编辑： 林白霜， 宋延君)

Effect of antisense locked nucleic acid blocking translation initiation region of c-myc exon 2 on apoptosis of hepatocellular carcinoma cells

DENG Yi-bin, XIAO Shu-rong, XU Gui-dan, HUANG Zan-song

(Center for Medical Laboratory Science, The Affiliated Hospital of Youjiang Medical College for Nationalities, Baise 533000, China. E-mail: 1019846481@qq.com)

AIM: To observe the effect of antisense locked nucleic acid (anti-LNA) blocking the translation initiation region ofc-mycexon 2 on the viability and apoptosis of hepatocellular carcinoma cells.METHODS: The anti-LNA that was complementary to the translation initiation region ofc-mycexon 2 was designed, synthesized, and introduced into the HepG2 cells by cationic liposome-mediated transfection. The mRNA and protein levels of c-Myc in the cells were determined by RT-PCR and Western blot. The change of cell apoptosis was analyzed by flow cytometry, and the toxicity of anti-LNA to the cells was detected by MTT assay.RESULTS: Five days after transfection, the mRNA level of c-Myc in anti-LNA group was 0.335±0.016, and the protein level was 0.448±0.037, significantly lower than those in control group (bothP<0.05). The ratio of apoptotic cells in anti-LNA group was 32%±6%, which was higher than that in control group (P<0.05).CONCLUSION: Antisense locked nucleic acid targeting at the translation initiation region ofc-mycexon 2 shows strong inhibitory effects on the apoptosis of hepatocellular carcinoma cells.

Hepatocellular carcinoma;c-mycgene; Antisense locked nucleic acid

1000- 4718(2017)09- 1602- 04

2016- 09- 12 [

] 2017- 05- 02

国家自然科学基金资助项目(No. 81460123)；广西卫生厅立项课题(No. Z2010084)；自治区级研究生教育创新计划项目(No. 201601005)

R961； R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.09.011

△通讯作者 Tel: 0776-2846532； E-mail: 1019846481@qq.com