染料木黄酮对氨诱导的星形胶质细胞NF-κB活化的影响*

杨 丹， 贾桂枝， 楚明会， 戴红良△

(锦州医科大学 1附属第一医院， 2基础医学院生理学教研室， 3护理学院， 辽宁 锦州 121001)

染料木黄酮对氨诱导的星形胶质细胞NF-κB活化的影响*

杨 丹1， 贾桂枝2， 楚明会3， 戴红良3△

(锦州医科大学1附属第一医院，2基础医学院生理学教研室，3护理学院， 辽宁 锦州 121001)

目的： 探讨染料木黄酮对氨所致星形胶质细胞NF-κB活化的影响及其机制。方法: 以氯化铵刺激原代培养的星形胶质细胞，建立高血氨模型，Western blot检测星形胶质细胞中ERK、Akt及核因子κB(NF-κB)的活化。结果: AG1478及染料木黄酮可显著抑制氨诱导的星形胶质细胞ERK及Akt的活化。LY294002、染料木黄酮及AG1478可显著抑制氨诱导的星形胶质细胞NF-κB核转位。结论: 染料木黄酮可显著抑制氨诱导的星形胶质细胞ERK活化和Akt介导的NF-κB活化，这可能是该天然物质抑制星形胶质细胞水肿的重要机制。

染料木黄酮； 氨； 星形胶质细胞； 核因子κB

高氨血症可引起多种疾病，其中最为重要的当属肝性脑病(hepatic encephalopathy，HE)和急性肝衰竭(acute liver failure，ALF)[1]。HE会发生于多数的肝病病人身上，其中慢性HE是最为常见的肝性脑病类型，患者会出现人格和情绪改变、智力降低及肌张力异常等变化；ALF诱发的HE一般由药物毒性引起，患者突然出现心理功能的降低及全身炎症，最终引发多器官衰竭和昏迷。脑水肿是伴随HE出现的重要神经病理改变，严重的脑水肿可引起颅内压升高，其死亡率极高[2]。星形胶质细胞水肿是高氨血症诱发脑水肿/颅内压升高的原因[3]。研究显示，当脑组织氨浓度达到3～5 mmol/L水平时即可引起星形胶质细胞水肿和肝性脑病。许多研究也均以3～5 mmol/L氨刺激星形胶质细胞水肿,从而建立肝性脑病体外模型[4-5]。

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)属酪氨酸激酶受体，该受体的激活是氨刺激诱导星形胶质细胞水肿的重要机制[5]。染料木黄酮(4’,5,7-三羟基异黄酮)是大豆及其制品中一种含量丰富的植物雌激素，具有广谱的受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)抑制活性，可抑制包括EGFR在内的多种RTK的活化[6]。之前我们的研究显示染料木黄酮可显著抑制氨诱导的星形胶质细胞水肿[7]，但其机制未明。在本研究中，我们拟利用体外培养的星形胶质细胞，从NF-κB活化角度探讨染料木黄酮对氨刺激下星形胶质细胞的保护机制。

材料和方法

1材料

氯化铵购于国药集团化学试剂有限公司；胎牛血清购于HyClone；DMEM培养基购于Corning；抗细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)、磷酸化ERK (p-ERK)、Akt、磷酸化Akt (p-Akt)Ⅰ抗及辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗购于Santa Cruz； 抗NF-κB I 抗购自Abcam；抗Lamin BⅠ抗购于Pierce。染料木黄酮、EGFR抑制剂AG1478、ERK抑制剂U0126和PI3K抑制剂LY294002均购自Sigma。

2方法

2.1星形胶质细胞培养及处理 取出生24 h内的SD大鼠大脑皮层，剥离脑膜及血管后，将脑组织切碎，加入0.125%胰蛋白酶37 ℃消化6 min，待细胞分散后，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基终止消化。将组织悬液先后用孔径为80 μm和10 μm的尼龙网过滤。将所得到的细胞以含10%胎牛血清的DMEM培养基调整密度为1×108～1×109/L, 置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。每3 d换液1次，第9天将培养的的星形胶质细胞置于水浴恒温振荡器上，在37 ℃、260 r/min条件下振摇 2 h以去除贴壁不牢的小胶质细胞和少突胶质细胞。仍贴壁的星形胶质细胞用0.25%的胰酶消化分散后传代培养。细胞传2～3代后进行实验。经胶质细胞原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)鉴定，星形胶质细胞纯度在95%以上(图1)。星形胶质细胞以3 mmol/L氯化铵刺激，AG1478(1 μmol/L)、染料木黄酮(70 μmol/L)、U0126(10 μmol/L)及LY294002(25 μmol/L)于加入氯化铵前30 min加入。

Figure 1. Identification of the purity of astrocyte cultures.

图1星形胶质细胞纯度鉴定

2.2Western blot实验 细胞以预冷PBS洗3遍，加入RIPA细胞裂解液 [临用前加入0.1%苯甲基磺酰氟(phenylmethyl sulfonylfluoride，PMSF)] 提取细胞总蛋白，或用核蛋白提取试剂盒提取核蛋白。BCA法测定蛋白浓度后行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。待电泳完成后电转移至聚偏氟乙烯(polyvinylidene di-fluoride，PVDF)膜。用1% BSA封闭1 h，接着加待检测蛋白的Ⅰ抗4 ℃孵育过夜。TBST充分洗膜后，以辣根过氧化物酶标记的 II 抗室温孵育2 h。TBST洗膜后，增强型化学发光液显色。 利用Quantity One软件(Bio-Rad)对条带灰度进行分析。

3统计学处理

数据采用SPSS 17.0统计软件进行分析。数值以均数±标准差(mean±SD)表示。多组间比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1AG1478及染料木黄酮对氨所致星形胶质细胞ERK活化的作用

与对照组相比，3 mmol/L氯化铵刺激组星形胶质细胞的p-ERK蛋白水平显著增加。EGFR特异性抑制剂AG1478组及染料木黄酮组的p-ERK蛋白水平与对照组无显著区别。AG1478+氯化铵组及染料木黄酮+氯化铵组的p-ERK蛋白水平与氯化铵组比较明显降低，见图2。

2AG1478及染料木黄酮对氨所致星形胶质细胞Akt活化的作用

与对照组相比，3 mmol/L氯化铵刺激组星形胶质细胞p-Akt的蛋白水平显著增加。EGFR特异性抑制剂AG1478组及染料木黄酮组的p-Akt蛋白水平与对照组无显著区别。AG1478+氯化铵组及染料木黄酮+氯化铵组的p-Akt蛋白水平与氯化铵组比较明显降低，见图3。

Figure 2. The effects of AG1478 (A) and genistein (B) on ammonia-induced ERK activation in the astrocytes. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol；#P<0.05vsNH4Cl.

图2AG1478及染料木黄酮对氨所致星形胶质细胞ERK活化的影响

Figure 3. The effects of AG1478 and genistein on ammonia-induced Akt activation in the astrocytes. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol；#P<0.05vsNH4Cl.

图3AG1478及染料木黄酮对氨所致星形胶质细胞Akt活化的影响

3U0126、LY294002、染料木黄酮及AG1478对氨致星形胶质细胞NF-κB活化的作用

与对照组相比，3 mmol/L氯化铵刺激组星形胶质细胞NF-κB的核转位显著增加。U0126不影响氨诱导的星形胶质细胞NF-κB核转位，但LY294002、染料木黄酮及AG1478则可显著抑制氨诱导的NF-κB核转位，见图4。

讨 论

EGFR是存在于细胞表面的、能够介导跨膜信号转导的RTK型受体。除了直接由其同源配体EGF诱导活化外，还可被H2O2、各种细胞因子及G蛋白偶联受体等间接激活。激活后的EGFR将信号整合至下游的各种信号转导通路[8-9]。

Figure 4. The effects of LY294002, U0126, genistein and AG1478 on ammonia-induced NF-κB nuclear translocation in the astrocytes. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsNH4Cl group.

图4U0126、LY294002、染料木黄酮及AG1478对氨所致星形胶质细胞NF-κB核转位的影响

我们之前研究证实，EGFR转激活在氨致星形胶质细胞水肿中具有重要作用。EGFR磷酸化激活后可诱导其下游信号转导分子的活化，如Ras/Raf/MEK/ERK及PI3K/Akt。MEK特异性抑制剂U0126及PI3K特异性抑制剂可抑制氨诱导的星形胶质细胞水肿[5]。作为一种广谱的酪氨酸激酶抑制剂，研究人员更多地关注染料木黄酮的抗肿瘤活性[10-11]。基于前期研究，我们最近尝试将染料木黄酮用于对氨刺激星形胶质细胞的保护，发现该天然物质可显著抑制氨诱导的星形胶质细胞水肿[6]。本研究在此基础上进一步证实染料木黄酮对星形胶质细胞水肿的抑制可能与其对氨刺激下ERK和Akt活化的抑制有关。

作为重要的转录因子，NF-κB可调控各种应激刺激下DNA的转录。其基本过程为受到刺激后，IκBα首先磷酸化降解，从而释放出与其结合的NF-κB p65亚单位，游离的p65随后便转位进入细胞核，从而调节各种基因的表达[12-13]。研究显示，氨可刺激星形胶质细胞内IκB的降解和NF-κB的核转位，而阻止NF-κB的转位则可完全抑制氨诱导的星形胶质细胞水肿，说明NF-κB的活化是氨介导星形胶质细胞毒性的重要机制[13]。虽然已有研究显示染料木黄酮可通过抑制NF-κB的核转位活化发挥其药理活性，但目前对该天然物质是否影响氨诱导的NF-κB转位活化尚不清楚。在本研究中我们证实染料木黄酮对氨诱导的星形胶质细胞NF-κB的活化具有显著的抑制作用。同时 ，我们还发现LY294002对氨诱导的NF-κB也具有显著的抑制作用。据此，我们推测染料木黄酮抑制NF-κB活化的机理可能源于其对Akt的抑制。

近年来，天然药物因其低毒高效的特点日益引起了科研人员的关注[14-15]。目前，临床上所使用的治疗肝性脑病的药物副作用大，且效果并不确定[4]。本研究证实染料木黄酮可显著抑制氨诱导的星形胶质细胞ERK活化，以及Akt介导的NF-κB核转位活化，这些作用可能是该天然物质抑制氨诱导的星形胶质细胞水肿的重要机制。而且，需要特别指出的是，由于肝性脑病经常出现于肝细胞癌晚期的病人身上[16]，而染料木黄酮具有抗肝细胞癌的活性[6,17]，因而价格低廉、副作用少的染料木黄酮可能尤其适用于肝癌合并肝性脑病的患者。

[1] Hertz L, Song D, Peng L, et al. Multifactorial effects on different types of brain cells contribute to ammonia toxicity[J]. Neurochem Res, 2017,42(3)：721-736.

[2] Jayakumar AR, Panickar KS, Murthy ChR, et al. Oxidative stress and mitogen-activated protein kinase phosphorylation mediate ammonia-induced cell swelling and glutamate uptake inhibition in cultured astrocytes[J]. J Neurosci, 2006, 26(18):4774-4784.

[3] Parekh PJ, Balart LA. Ammonia and its role in the pathogenesis of hepatic encephalopathy[J]. Clin Liver Dis, 2015, 19(3):529-537.

[4] Sturgeon JP, Shawcross DL. Recent insights into the pa-thogenesis of hepatic encephalopathy and treatments[J]. Expert Rev Gastroenterol Hepatol, 2014, 8(1): 83-100.

[5] Dai H, Song D, Xu J, et al. Ammonia-induced Na,K-ATPase/ouabain-mediated EGF receptor transactivation, MAPK/ERK and PI3K/AKT signaling and ROS formation cause astrocyte swelling[J]. Neurochem Int, 2013, 63(6): 610-625.

[6] 戴红良， 贾桂枝， 赵 艳， 等. 染料木黄酮通过抑制EGFR/ERK通路抗肝癌SMMC7721细胞增殖[J]. 辽宁医学院学报, 2015, 36(1):1-3， 21.

[7] 韩思雨， 隋海娟， 贾桂枝， 等. 染料木黄酮对氨致星形胶质细胞水肿的抑制作用[J]. 辽宁医学院学报， 2016, 37(5):4-5， 9.

[8] Fan JB, Liu W, Yuan K, et al. EGFR trans-activation mediates pleiotrophin-induced activation of Akt and ERK in cultured osteoblasts[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2014, 447(3):425-430.

[9] 姜雪梅， 贾桂枝， 楚明会， 等. EGFR转激活对氨诱导星形胶质细胞p38MAPK活化的影响[J]. 广东医学, 2016, 37(24):1-4.

[10] Nakamura H, Wang Y, Kurita T, et al. Genistein increases epidermal growth factor receptor signaling and promotes tumor progression in advanced human prostate cancer[J]. PLoS One, 2011, 6(5):e20034.

[11] Gruca A, Krawczyk Z, Szeja W, et al. Synthetic genistein glycosides inhibiting EGFR phosphorylation enhance the effect of radiation in HCT 116 colon cancer cells[J]. Molecules, 2014, 19(11):18558-18573.

[12] Amin FU, Shah SA, Kim MO. Glycine inhibits ethanol-induced oxidative stress, neuroinflammation and apoptotic neurodegeneration in postnatal rat brain[J]. Neurochem Int, 2016, 96:1-12.

[13] Sinke AP, Jayakumar AR, Panickar KS, et al. NFκB in the mechanism of ammonia-induced astrocyte swelling in culture[J]. J Neurochem, 2008, 106(6):2302-2311.

[14] 戴红良，贾桂枝，赵 颂，等. 黄芪多糖对异丙肾上腺素诱发的SERCA2a表达及活性降低的影响[J]. 中国药理学通报, 2015, 31(3):388-391.

[15] 戴红良，葛树卿，楚明会，等. 染料木黄酮通过抑制VEGF表达抑制人口腔癌TCA8113细胞增殖[J]. 中国病理生理杂志, 2016, 32(3):464-469.

[16] Liu TH, Liu DH, Mo CJ, et al. Glycosylation patterns and PHA-E-associated glycoprotein profiling associated with early hepatic encephalopathy in Chinese hepatocellular carcinoma patients[J]. Am J Transl Res, 2016, 8(10): 4250-4264.

[17] Roh T, Kim SW, Moon SH, et al. Genistein induces apoptosis by down-regulating thioredoxin-1 in human hepatocellular carcinoma SNU-449 cells[J]. Food Chem Toxicol, 2016, 97:127-134.

(责任编辑： 卢 萍， 罗 森)

Effect of genistein on ammonia-induced NF-κB activation in astrocytes

YANG Dan1, JIA Gui-zhi2, CHU Ming-hui3, DAI Hong-liang4

(1The First Affiliated Hospital,2Department of Physiology, College of Basic Medical Sciences,3School of Nursing, Jinzhou Medical University, Jinzhou 121001, China. E-mail: jy2006hldai@sohu.com)

AIM: To explore the effect of genistein on ammonia-induced nuclear factor-κB (NF-κB) activation and the underlying mechanism.METHODS: Primary astrocyte cultures were prepared and challenged with NH4Cl to establish a hyperammonemic model. The activation of ERK, Akt and NF-κB was examined by Western blot.RESULTS: AG1478 and genistein significantly inhibited ammonia-induced activation of ERK and Akt. Ammonia-induced NF-κB nuclear translocation was significantly inhibited by the pretreatment of LY294002, genistein and AG1478.CONCLUSION: Genistein significantly inhibited ammonia-induced ERK activation and Akt-mediated NF-κB activation, which might represent the important mechanism by which this naturally occurring substance exerts its swelling-inhibiting effect.

Genistein; Ammonia; Astrocytes; Nuclear factor-κB

1000- 4718(2017)09- 1598- 04

2016- 12- 11 [

] 2017- 05- 27

辽宁省自然科学基金资助项目(No. 2015020360)；辽宁医学院校长基金-奥鸿博泽基金(No. XZJJ20140111)；2015年辽宁省大学生创新创业训练计划项目(乙类)(No. 201510160000035)；辽宁医学院校长基金-奥鸿博泽大学生科技创新基金(No. 2015D20)

R363.2+1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.09.010

△通讯作者 Tel: 0416-4673688; E-mail: jy2006hldai@sohu.com