高速逆流色谱技术分离纯化藜芦中甾体类生物碱

姜姣姣，闫慧娇，文蕾，郑秀花，王晓*，陈燕平

(1.山东中医药大学 药学院，山东 济南 250355；2.山东省中药质量控制技术重点实验室 山东省分析测试中心，山东 济南 250014;3.烟台出入境检验检疫局，山东 烟台 264000)

·基础研究·

高速逆流色谱技术分离纯化藜芦中甾体类生物碱

姜姣姣1，2，闫慧娇2，文蕾1，2，郑秀花1，2，王晓2*，陈燕平3

(1.山东中医药大学 药学院，山东 济南 250355；2.山东省中药质量控制技术重点实验室 山东省分析测试中心，山东 济南 250014;3.烟台出入境检验检疫局，山东 烟台 264000)

目的：采用高速逆流色谱(HSCCC)技术对藜芦中的甾体类生物碱进行分离鉴定。方法：以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(5∶5∶3∶7，V/V)为溶剂系统，在转速为850 r·min-1、流速为2.0 mL·min-1、检测波长为280 nm的实验条件下进行分离。结果：从300 mg粗提物中分离得到2.1 mg的藜芦酰棋盘花胺(veratroylzygadenine)和9.3 mg的介芬胺(Jervine)，经HPLC分析，其纯度分别为91.34%、98.10%。结论：该方法简便、重现性好、分离量大，适合于甾体类生物碱的分离纯化。

高速逆流色谱；藜芦；甾体类生物碱

藜芦VeratrumnigrumL.为百合科藜芦属植物[1]，多年生草本，主要生长在海拔较高的山坡林下或草丛中，主产于中国的东北、华北、贵州、陕西等地区[2]。藜芦又名黑藜芦、山葱，在《神农本草经》、《别录》和《本草纲目》中均有记载，其味辛、苦，性寒，具有祛痰、催吐、杀虫等作用[3]，通常用于治疗中风、癫痫、虐疾、跌打损伤、头癣等疾病，此外还可灭蛆、蝇[4]，其主要药效成分有藜芦生物碱、茋类、二肽类、黄酮类及其他化合物[5]。

近年来，研究发现藜芦中有效成分藜芦生物碱还具有强心降压、改善脑循环、抗癌等生理活性[6-7]，但是目前国内对藜芦生物碱的研究还比较少。藜芦生物碱主要为甾体类生物碱，其基本母核为胆甾烷类化合物，特点是没有紫外吸收，且含量较低，为藜芦生物碱的分离纯化增加了很大的难度。传统的分离方法主要包括柱色谱法[8]、薄层色谱法[9]、高效液相色谱法[10]等。这些方法不仅耗费时间长、效率低，还容易对被分离成分产生死吸附、变性等影响。为了进一步研究藜芦生物碱的生理活性，更好地开发利用藜芦生物碱，本文研究建立一种高效的分离制备藜芦生物碱的方法，制备了纯度较高的藜芦酰棋盘花胺和介芬胺两个单体化合物(化学结构式见图1)。

图1 藜芦酰棋盘花胺和介芬胺的化学结构

1 仪器与材料

TBE-300A高速逆流色谱仪(上海同田生物技术有限公司)，该系统由TBP5002泵、多层聚四氟乙烯螺旋管、8823-B紫外检测器(上海胜斯贸易有限公司)、3057-11记录仪(上海精科实业有限公司)组成；Agilent 1260高效液相色谱系统[配有蒸发光散射检测器(ELSD)，美国Agilent 公司]；旋转蒸发仪(上海况胜科技有限公司)。

样品前处理以及高速逆流色谱中所用到的石油醚、乙酸乙酯、甲醇均为分析纯(邹平鲁岳化工有限公司)，水为过滤蒸馏水；高效液相色谱所用乙腈为色谱纯(美国天地公司)，实验用水为过滤蒸馏水及娃哈哈纯净水。

藜芦药材购于哈尔滨三棵树药材专业市场，经山东中药医药大学李佳教授鉴定为百合科植物藜芦VeratrumnigrumL.的干燥根茎。

2 方法

2.1藜芦生物碱粗提物的制备

将藜芦药材5kg粉碎，过40目筛，将其平均置于3个10L的圆底烧瓶中，分别加入95%的乙醇6L回流提取3次(提取时间分别为3、2、2h)，过滤，合并滤液，减压浓缩至无乙醇味道，得浓缩液1200mL。在浓缩液中慢慢加入10%HCl溶液，调节溶液pH值达到3，然后加入等体积的石油醚萃取3次，将石油醚萃取后的水相加入氨水调节溶液至pH值达到10，得沉淀105g。将105g沉淀溶于pH值为10的碱水溶液中，超声振荡后用乙酸乙酯萃取，回收溶剂得乙酸乙酯萃取物，将其用酸水溶解后，再加入氨水调节pH值为10，过滤得较纯样品30g，用于进一步分离。

2.2两相溶剂系统和样品溶液的制备

实验所采用的溶剂体系为石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(5∶5∶3∶7，V/V)，将上述溶剂按比例置于2000mL的分液漏斗中，充分振荡，静置，使其分层。使用前分出上下相，将上层溶液作为固定相，下层作为流动相，放于不同容器中，然后超声脱气5min，待用。

取400mg纯化后的样品，因其溶解性差，在上相中稍好，故取上述溶剂系统的上相溶解样品，作为样品溶液。

2.3分离和鉴定

2.3.1HSCCC的分离制备过程 将预先准备好的上相，以20mL·min-1的流速泵入HSCCC的螺旋管中，待上相充满HSCCC的螺旋管时，启动仪器，顺时针缓慢调节转速至850r·min-1，转速稳定后，以2mL·min-1的流速泵入下相，当在出口观察到有下相流出时，说明上下相已经建立了动态平衡。将样品溶液通过进样阀注入分离柱中，然后开启紫外检测器(检测波长280nm)和记录仪，根据HSCCC图谱手动收集馏分。

2.3.2HPLC分析 根据HSCCC图谱将分离得到的馏分及吹出液用HPLC进行分析。色谱柱为InertsilODS-SP(250mm×4.6mm，5μm)；柱温为25℃；检测波长为265nm；流动相为乙腈(A相)、0.1%三氟乙酸水溶液(B相)，梯度洗脱(0～5min，20%A；5～30min，20%A～40%A；30～40min，40%～100%A；40～45min，100%A)；流速为1.0mL·min-1；进样量：20μL。

3 结果与讨论

3.1HPLC条件的优化

本实验考察了甲醇-水、乙腈-0.05%甲酸水溶液、甲醇-0.1%三氟乙酸水溶液和乙腈-0.1%三氟乙酸水溶液等作为流动相时样品中各组分的分离效果，也考察了等度洗脱和梯度洗脱的影响。结果发现当采用乙腈-0.1%三氟乙酸的水溶液进行梯度洗脱时，样品中的各组分具有较好的分离效果，如图3所示。

3.2HSCCC分离条件的优化

HSCCC分离效果的好坏关键在于所选择的溶剂系统是否合适，而溶剂系统是根据两相溶剂中的分配系数(KD)为指标来决定的。通常，KD值范围是0.5～2.0时说明此溶剂系统较好[11]。本实验利用HPLC测定了在不同比例的石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水中目标化合物的KD值。结果发现，当溶剂体系石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水的比例为5∶5∶3∶7时，样品中的两个生物碱具有合适的KD值，见表1。

表1 样品中的2个生物碱在不同溶剂系统中的KD值

从表1中的数据可以看出，样品中的2个生物碱在石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(6∶4∶6∶4，V/V)的溶剂系统中KD值较小，使用这个溶剂系统能够很快洗脱样品中的2个生物碱，因此两组分将得不到较好的分离。当溶剂系统为石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(4∶6∶4∶6，V/V)时，化合物1、2的KD值分别为1.12和2.34，可以看出此时的KD偏大，需要较长的时间才能使两个组分洗脱出来。而溶剂系统为石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水5∶5∶4∶6和5∶5∶3∶7时，两个目标化合物的KD值基本符合要求。通过实验发现，当石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水体积比为5∶5∶3∶7更为合适，两组分的分离效果更好，且分离时间较短。

3.3HSCCC分离纯化

利用上述优化的溶剂系统石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(5∶5∶3∶7，V/V)进行化合物的分离。一次进样300mg藜芦生物碱粗提物，在5.5h内完成一次分离，根据图2进行馏分的手动收集，最终得到藜芦酰棋盘花胺(峰1)2.1mg和介芬胺(峰2)9.3mg，分离制备的化合物经HPLC进行分析，其纯度分别为91.34%和98.10%(见图3)。

注：1.藜芦酰棋盘花胺峰；2.介芬胺峰。图2 藜芦中甾体生物碱的的HSCCC图谱

注：A.藜芦粗提物；B.藜芦酰棋盘花胺；C.介芬胺；1.藜芦酰棋盘花胺峰；2.介芬胺峰。图3 藜芦粗提物及得甾体生物碱的HPLC图

3.4化合物的结构鉴定

化合物1：无色针状结晶，碘化铋钾试剂显黄色，1H-NMR (600 MHz，DMSO-d6)，δ：1.06 (3H，s，H-19)，1.08 (3H，d，J=7.0 Hz，H-27)，1.25 (3H，s，H-21)，3.29 (1H，s，OH-20)，3.81 (3H，s，OMe-4′)，3.84 (3H，s，OMe-5′)；13C-NMR (150 MHz，DMSO-d6) δ：32.64 (C1)，26.76 (C2)，75.47 (C3)，104.15 (C4)，46.64 (C5)，19.17 (C6)，17.02 (C7)，43.92 (C8)，95.41 (C9)，43.92 (C10)，95.41 (C11)，46.92 (C12)，32.85 (C13)，80.52 (C14)，69.58 (C15)，70.30 (C16)，45.56 (C17)，63.52 (C18)，19.51 (C19)，72.06 (C20)，19.71 (C21)，70.75 (C22)，17.59 (C23)，30.93 (C24)，26.76 (C25)，62.52 (C26)，17.42 (C27)，165.30 (C1′)，122.70 (C2′)，111.57 (C3′)，148.91 (C4′)，153.48 (C5′)，112.22 (C6′)，123.63 (C7′)，56.14 (COMe-4′)，55.95 (COMe-5′)。以上数据与文献对比[12-13]，数据基本一致，鉴定为藜芦酰棋盘花碱(veratroylzygadenine) 。

化合物2：无色针状结晶，碘化铋钾试剂显黄色，1H-NMR (600 MHz，DMSO-d6)，δ：0.93(3H，d，J=6.4Hz，H-27)，1.12(3H，d，J=7.1Hz，H-21)，1.09(3H，s，H-19)，2.06(3H，s，H-18)，2.50(1H，m，H-8)，2.52(1H，m，H-14)，3.05(1H，m，H-22)，3.28(1H，m，H-23)，3.52 (1H，m，H-3)，5.33(1H，m，H-6)；13C-NMR(150 MHz，DMSO-d6)，δ：36.95 (C1)，31.26 (C2)，70.48 (C3)，41.82 (C4)，142.75 (C5)，120.79 (C6)，30.42 (C7)，38.37 (C8)，62.09 (C9)，38.17 (C10)，206.88 (C11)，137.05 (C12)，145.75 (C13)，44.09 (C14)，24.51 (C15)，30.61 (C16)，85.1 (C17)，12.08 (C18)，18.51 (C19)，41.23 (C20)，11.13 (C21)，66.39 (C22)，75.58 (C23)，38.94 (C24)，32.07 (C25)，54.06 (C26)，19.08 (C27)。以上数据与文献对比[14-15]，数据基本一致，鉴定为介芬胺(jervine)。

4 结论

藜芦具有广泛的药用价值，为了进一步筛选出具有药理活性的化学成分，需要高纯度的单体化合物，因此高效快速地分离纯化技术显得尤为重要。本研究采用酸溶碱沉的方法对藜芦中生物碱进行提取，然后将粗提物作为样品，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(5∶5∶3∶7，V/V)为溶剂系统，经一次高速逆流色谱分离，在5 h内从300 mg藜芦粗提物中得到藜芦酰棋盘花胺(2.1 mg)和介芬胺(9.3 mg)，纯度分别为91.34%和98.10%。该方法简便易操作，且所得单体纯度高，为甾体类生物碱制备及分离提供了一种新思路。

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SeparationandPurificationofSteroidalAlkaloidsfromVeratrumnigrumbyHigh-speedCounter-currentChromatography

JIANG Jiaojiao1，2，YAN Huijiao2，WEN Lei1，2，ZHENG Xiuhua1，2，WANG Xiao2*，CHEN Yanping3

(1.ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine，Jinan250355，China；2.KeyLaboratoryofTCMQualityControlTechnology，ShandongAnalysisandTestCenter，Jinan250014，China；3.YantaiEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Yantai264000,China)

Objective：To separate and purify steroidal alkaloids from the crude extract ofVeratrumnigrumL.by HSCCC.Methods：Petroleum ether-ethyl acetate-methanol-water (5∶5∶3∶7，V/V) was used as the solvent system.Separation was performed at a rotating speed of 800 r·min-1.The flow rate was 2.0 mL·min-1and the detection wavelength was set at 280 nm.Results：2.1 mg veratroylzygadenine and 9.3 mg jervine were purified from 300 mg of the crude extract with the purity of 91.34% and 98.10% determined by HPLC，respectively.Conclusion：The method is simple，good reproducible and efficient which is suitable for the separation of steroidal alkaloids.

High-speed counter-current chromatography；VeratrumnigrumL.；steroidal alkaloids

国家自然基金(ZR2016YL006)；山东省科技进步计划(2014GZX219003)

] 王晓，研究员，博士，硕士生导师，研究方向：天然产物研究与开发；Tel：(0531)82605319，E-mail：wangx@sdas.org

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.5.011

2016-07-20)

*[