正交试验设计筛选黄连总生物碱的提取纯化工艺研究

熊玲，覃瑶，罗维早，3，肖坤全，王欣

(1.成都市食品药品检验研究院，四川 成都 610045；2.太极集团有限公司，重庆 401147；3.重庆市中药研究院，重庆 400065)

·中药工业·

正交试验设计筛选黄连总生物碱的提取纯化工艺研究

熊玲1，覃瑶2，罗维早2，3，肖坤全2，王欣3*

(1.成都市食品药品检验研究院，四川 成都 610045；2.太极集团有限公司，重庆 401147；3.重庆市中药研究院，重庆 400065)

目的：筛选黄连总生物碱最佳提取工艺。方法：采用正交试验设计，以小檗碱、巴马汀、黄连碱、表小檗碱的转移率为指标，筛选最佳的提取参数。在此基础上综合提取转移率、能耗及成本因素对提取工艺进行优化。结果：以70%乙醇作为提取溶剂，提取3次，每次1 h，溶剂用量分别为8、6、6倍为最佳提取工艺。结论：所筛选的提取工艺能够有效提取出黄连中的主要活性成分。

黄连；正交设计；生物碱；提取工艺

1 材料与仪器

1.1药品与试剂

盐酸巴马汀对照品(批号：110732-200506)、盐酸小檗碱对照品(批号：110713-200208)、盐酸药根碱对照品(批号：0733-200005)(中国食品药品检定研究院)；HPLC试剂为色谱纯；其余各试剂均使用分析纯。

黄连药材于2012年3月采集于重庆石柱当地，经瞿显友研究员、舒抒副研究员鉴定为毛茛科植物黄连CoptischinensisFranch.的干燥根茎。

1.2仪器

LC-2010型液相色谱仪(岛津)；AUW220D型电子天平(十万分之一，日本岛津公司)；BS224S型电子天平(万分之一，德国赛多利斯公司)；KQ250DB型数控超声波清洗器 (巩义市予华仪器有限责任公司)；KQ5200型水浴锅(昆山市超声仪器有限公司)；DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱(巩义市予华仪器有限责任公司)；Delta320pH计(Mettler-ToledoGroup)；三用紫外线分析仪(上海顾村电光仪器厂)；大孔树脂D101(蚌埠市辽源新材料有限公司)；DAISO反相C18硅胶填料(60μm，北京颇赛科技发展有限公司)；预制硅胶板(青岛谱科分离材料有限公司)。

2 实验方法及结果

2.1样品的制备

2.1.1对照品溶液的制备 精密称取盐酸药根碱、盐酸非洲防己碱、盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱6种对照品适量，置于50mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，得到各对照品质量浓度分别为22.2、19.0、65.8、93.4、58.2、281.2μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.1.2供试品溶液的制备 精密量取提取液1mL，加甲醇∶浓盐酸(100∶1)稀释至25mL，摇匀，离心(10000r·min-1)，即得HPLC样品。

2.1.3药材样品溶液的制备 取药材粉末(过四号筛)约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-浓盐酸(100∶1)的混合液50mL，密塞，称定重量，超声处理(功率：250W，频率：40kHz)30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，离心(10000r·min-1)，即得。

2.2色谱条件

WelchMaterialsXtimateTMC18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相A为乙腈，B为30mmol·L-1碳酸氢铵溶液(每1000mL碳酸氢铵溶液含7mL氨水及1mL三乙胺)，梯度洗脱条件：0～15minA∶B为(10～25)∶(90～75)，15～25minA∶B为(25～30)∶(75～70)，25～40minA∶B为(30～45)∶(70～55)。流速为1mL·min-1；检测波长为270nm；柱温为30℃；进样量10μL。理论塔板数按盐酸药根碱、盐酸非洲防己碱、盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱峰计算均不低于5000。

2.3回流提取正交试验

以黄连中6个生物碱(小檗碱、巴马汀、黄连碱、表小檗碱、非洲防己碱、药根碱)的转移率为考察指标，取黄连药材粗粉进行正交试验。主要因素为溶媒用量(A)、提取时间(B)、乙醇浓度(C)、提取次数(D)，根据黄连中生物碱类成分的提取有关文献[1-4]，选择L9(34)正交表进行试验。

取黄连药材粗粉9份，每份150g，分别进行回流提取，收集提取液，按2.1样品的制备配制HPLC样品，按2.2色谱条件测定样品，计算转移率。

表1 因素水平表

表2 小檗碱提取转移率正交试验结果

由表3可知，D因素的F比>F0.05，D因素对该指标的影响有显著性意义，且非常重要；由小檗碱转移率正交试验结果表直观分析R可知，其影响因素大小依次为D>A>C>B。由直观分析可以看出，最佳提取工艺为A3B2C3D3，即用8倍量75%的乙醇提取3次，每次1 h。

表3 方差分析表(小檗碱)

注：以B因素的偏差平方和为误差。

由表5可知，D因素的F比>F0.05，D因素对该指标的影响有显著性意义，且非常重要；由巴马汀转移率正交试验结果表直观分析R可知，其影响因素大小依次为D>A>C>B。由直观分析可以看出，最佳提取工艺为A3B2C3D3，即用8倍量75%的乙醇提取3次，每次1 h。

表4 巴马汀提取转移率正交试验结果

表5 方差分析表(巴马汀)

注：以B因素的偏差平方和为误差。

由表7可知，D因素的F比>F0.05，D因素对该指标的影响有显著性意义，且非常重要；由黄连碱转移率正交试验结果表直观分析R可知，其影响

表6 黄连碱提取转移率正交试验结果

因素大小依次为D>A>C>B。由直观分析可以看出，最佳提取工艺为A3B2C3D3，即用8倍量75%的乙醇提取3次，每次1 h。

表7 方差分析表(黄连碱)

注：以B因素的偏差平方和为误差。

由表9可知，D因素的F比>F0.05，D因素对该指标的影响有显著性意义，且非常重要；由小檗碱转移率正交试验结果表直观分析R可知，其影响因素大小依次为D>A>C>B。由直观分析可以看出，最佳提取工艺为A3B2C3D3，即用8倍量75%的乙醇提取3次，每次1 h。

表8 表小檗碱提取转移率正交试验结果

表9 方差分析表(小檗碱)

注：以C因素的偏差平方和为误差。

由表11可知，D因素的F比>F0.05，D因素对该指标的影响有显著性意义，且非常重要；由非洲防己碱转移率正交试验结果表直观分析R可知，其影响因素大小依次为D>A>C>B。由直观分析可以看出，最佳提取工艺为A3B2C3D3，即用8倍量75%的乙醇提取3次，每次1 h。

表10 非洲防己碱提取转移率正交试验结果

表11 方差分析表(非洲防己碱)

注：以B因素的偏差平方和为误差。

由表13可知，D因素的F>F0.05，D因素对该指标的影响有显著性意义，且非常重要；由药根碱转移率正交试验结果表直观分析R可知，其影响因素大小依次为D>A>C>B。由直观分析可以看出，最佳提取工艺为A3B2C3D3，即用8倍量75%的乙醇提取3次，每次1 h。

回流提取正交试验结果可知，回流提取黄连中6个生物碱(小檗碱、巴马汀、黄连碱、表小檗碱、非洲防己碱、药根碱)最佳提取工艺都为A3B2C3D3，即用8倍量75%的乙醇提取3次，每次1 h。

表12 药根碱提取转移率正交试验结果

表13 方差分析表(药根碱)

注：以B因素的偏差平方和为误差。

2.4优化实验

根据上述实验结果，从大生产时节约能耗，减少成本的角度出发，以黄连中6个生物碱(小檗碱、巴马汀、黄连碱、表小檗碱、非洲防己碱、药根碱)的转移率为考察指标，分别称取黄连药材粗粉150g，共9份，分成3组；每组分别用70%、75%、80%乙醇加热回流提取3次，每次溶剂用量为8、6、6倍，即1200、900、900mL，每次回流1h，合并3次的提取液，按2.1样品的制备配制HPLC样品，按2.2色谱条件测定样品，计算转移率。

从表14可知，70%乙醇为提取溶剂，各生物碱转移率最高。

2.5验证实验

根据上述实验结果，分别称取黄连药材粗粉500g，共3份，加入70%乙醇，各提取3次，每次1h，溶剂用量分别为8、6、6倍，即4000、3000、3000mL，合并3次的提取液，按2.1方法配制HPLC样品，按2.2色谱条件测定样品，计算转移率，结果见表15。

表14 回流提取转移率一览表

表15 回流提取转移率一览表

3 讨论

黄连始载于《神农本草经》，列为上品。《本草纲目》中记载：“其根连珠而色黄，故名。”自古以来认为四川为主产地。有泻火、燥湿、解毒、杀虫的功能。现代医学研究成果表明，黄连抗菌、抗炎、镇痛、降糖等活性均与黄连中多种生物碱密切相关，黄连药材的主要活性成分为其中的生物碱，包括小檗碱、黄连碱、巴马汀、表小檗碱等。2010版《中华人民共和国药典》一部对黄连制定了4种生物碱的含量限度；依据多成分含量测定符合中药多成分的特点，更有利于中药材质量控制的整体性和客观性。但仅对药材进行质量控制，并不能保证成药的质量。成药安全有效需依赖于合理的制备工艺及完善的质量控制[6]。现有的黄连提取工艺多采用小檗碱作为单一指标成分进行黄连提取工艺的筛选和研究[7-9]，而黄连另含有其他多种生物碱，其含量同样影响黄连及其提取物的质量，单一选择一种生物碱作为指标成分进行黄连提取工艺的筛选不能体现中药多成分多指标的特色，更不能保证成品的有效性和可控性，故本研究采用多成分作为指标对黄连的提取工艺进行筛选，为后续黄连成药的制备提供依据。

正交试验设计中，以多成分为指标筛选出的最佳提取工艺为8倍量75%的乙醇提取3次，每次1 h。结合能耗及实际生产成本的考虑，在此参数上进行了微调和验证，确定最终的最佳提取工艺为以70%乙醇作为提取溶剂，提取3次，每次1 h，溶剂用量分别为8、6、6倍。

[1] 张红梅，程雪梅，王长虹，等.黄连中生物碱提取工艺的正交试验研究[J].中国医药工业杂志，2008，39(8)：588-590.

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[3] 张乐佳，夏新华.黄连提取工艺的研究[J].中成药，2001，23(6)：398-400.

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[7] 彭福，瞿显友，钟国跃，等.HPLC法测定黄连不同部位中6个生物碱[J].中草药，2014，43(3)：509-512.

[8] 阳勇，李铁刚，朱晶晶，等.HPLC法测定黄连药材及其炮制品中主要生物碱的含量[J].中成药，2010，32(9)：1540-1544.

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(2016-09-20)

StudyonExtractionandPurificationTechnologyofTotalAlkaloidsfromRhizomaCoptidisbyOrthogonalDesign

XIONG Ling1，QIN Yao2，LUO Weizao2，3，XIAO Kunquan2，WANG Xin3*

(1.ChengduCenterforFood&DrugControl，Sichuan，610045，P.R.China；2.TaijiGroup，Chongqing，401147，P.R.China；3.ChongqingInstituteofChineseMateriaMedica，Chongqing，400065，P.R.China)

Objective：To screen the optimal extraction technology of total alkaloids from Rhizome Coptidis.Methods：The extraction parameters were optimized by using orthogonal experiment design with the transfer rate of berberine，palmartin，coptisine，epiberberine as the index.Combining the comprehensive extraction rate，power consumption and cost factors，the extraction process was further optimized.Results：The optimal process was as follows：70% ethanol as solvent，extracting 3 times，each time 1 h，amount of solvent 8，6，6 times，respectively.Conclusion：The selected extraction technology can effectively extract the major active constituent of Rhizoma Coptidis.

Rhizoma Coptidis；orthogonal design；alkaloid；extraction process

] 王欣，副研究员，研究方向：中药化学成分与药效物质基础研究；E-mail:wangxin-cq386@sina.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.5.023

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