离子液体超声提取五味子木脂素的工艺研究△

张继丹，李化*，柯华香，邵爱娟，杨滨

(1.中国中医科学院 中药研究所，北京 100700；2.道地药材国家重点实验室培育基地，北京 100700；3.西华大学 食品与生物工程学院，四川 成都 610039)

·中药工业·

离子液体超声提取五味子木脂素的工艺研究△

张继丹1，2，李化1，2*，柯华香1，3，邵爱娟1，2，杨滨1，2

(1.中国中医科学院 中药研究所，北京 100700；2.道地药材国家重点实验室培育基地，北京 100700；3.西华大学 食品与生物工程学院，四川 成都 610039)

目的：研究离子液体超声提取五味子木脂素的最佳提取工艺。方法：以五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的含量为指标，分别考察离子液体种类、浓度、料液比、提取温度和超声时间对提取效果的影响，得出最佳提取工艺参数；将所得的最佳提取工艺与超声提取法和回流提取法比较。结果：五味子木脂素的最佳提取工艺为以0.4 mol·L-1的溴化1-丁基-3-甲基咪唑[C12MIM][Br]为提取溶剂，料液比1∶30，温度30 ℃，超声提取10 min时，效果最佳。结论：离子液体超声提取法简便快速，可用于五味子中木脂素的快速提取。

离子液体；五味子；木脂素成分；提取方法

离子液体(Ionic liquids，ILs)主要由有机阳离子和无机阴离子组成，是在室温或接近室温(低于100 ℃)下呈液体状态的熔融盐[1]。与常见的有机溶剂相比，离子液体的蒸汽压低、挥发性弱、稳定性好，不易燃易爆；同时，离子液体具有可调节性，能根据所提化合物的特点，选择合适的阴、阳离子。由于离子液体超声提取法具有所需设备价格低廉、操作简便、提取时间短、溶剂用量少等特点，目前已有离子液体用于中药中生物碱[2]、黄酮[3]、皂苷[4]等成分的提取报道，并得到了良好的实验结果。

中药五味子为木兰科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.的干燥成熟果实，具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心的功能，用于久嗽虚喘、梦遗滑精、遗尿尿频等病症的治疗[5]。中药五味子中的化学成分有木脂素、挥发油、多糖等，其中木脂素类成分是其主要化学成分[6]，也是2015版《中华人民共和国药典》评价五味子质量的指标成分。文献报道的提取五味子中木脂素的方法有回流提取[7]、超高压水射流提取[8]、微波提取[9]、闪式提取[10]、超临界提取[11]以及高压脉冲电场提取[12]等，这些方法大多采用挥发性较强的有机溶剂，易对人体健康和生态环境产生不利影响，且部分提取技术采用高压设备，存在成本昂贵等问题。本研究拟以离子液体为提取溶剂，采用超声法对五味子中木脂素的提取工艺进行研究。

1 仪器与试药

1.1仪器

WatersACQUITYH-ClassUPLCTM超高效液相色谱仪(包括四元溶剂系统、真空脱气机、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器、EmpowerⅡ色谱工作站)；Milli-Q型超纯水制备仪(法国Millipore公司)；Eppendorf离心机；ScoutPro型电子天平(美国Ohaus公司)；2004MP6型半微量电子显示天平(德国Sartorius公司)；KQ-100DE型医用数控超声波清洗器(功率：100W，昆山市超声仪器有限公司)。

1.2试药

溴化1-丁基-3-甲基咪唑[C4MIM][Br]、溴化1-己基-3-甲基咪唑[C6MIM][Br]、溴化1-辛基-3-甲基咪唑[C8MIM][Br]、溴化1-癸基-3-甲基咪唑[C10MIM][Br]和溴化1-十二烷基-3-甲基咪唑[C12MIM][Br](上海成捷化学品公司)；五味子醇甲(批号MUST-13061206，纯度≥98%)、五味子醇乙(批号MUST-14010312，纯度≥98%)、五味子酯甲(批号MUST-13110606，纯度≥98%)、五味子甲素(批号MUST-13080205，纯度≥98%)、五味子乙素(批号MUST-13091606，纯度≥98%)(成都曼思特生物科技有限公司)；乙腈和甲醇为色谱纯(美国Fisher公司)；其他试剂均为分析纯；超纯水由Mili-Q纯水机制备。

五味子药材购自北京同仁堂药店，经中国中医科学院中药研究所杨滨研究员鉴定为木兰科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz) Baill.的干燥成熟果实。药材粉碎过40目筛。

2 方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱为AquityBEHC18(50mm×2.1mm，1.7μm)；检测波长为235nm；柱温为45 ℃；流动相为水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱见表1[13]；进样量为1μL；流速为0.4mL·min-1，对照品和样品的色谱图见图1。

表1 洗脱梯度

注：A.木脂素混合对照品；B.样品溶液；1.五味子醇甲；2.五味子醇乙；3.五味子酯甲；4.五味子甲素；5.五味子乙素。图1 木脂素混合对照品、样品溶液的UPLC图

2.2对照品溶液的制备

取五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素适量，精密称定，用甲醇溶解，制成上述5种成分的浓度分别为0.2216、0.1012、0.0202、0.0849、0.1656mg·mL-1的混合对照品溶液。

2.3离子液体超声辅助提取工艺优化

考察离子液体种类、离子液体浓度、超声温度、提取时间和料液比对五味子中5种木脂素含量和总木脂素含量(5种木脂素各含量之和)的影响，各因素水平见表2。

表2 提取工艺因素与水平

2.3.1 离子液体种类对提取效果的影响 以Br-1为阴离子的离子液体具有化学结构稳定、提取率高等特性[14]，因此本文将Br-1作为阴离子，着重考察阳离子种类对提取效果的影响。

取五味子粉末0.2 g，精密称定，准确加入不同种类的离子液体(浓度为0.4 mol·L-1)4 mL，30 ℃超声30 min，离心10 min (4000 r·min-1)，滤过(0.2 μm)，按2.1项下的色谱条件进行测定，采用外标两点法计算各样品中木脂素的含量，考查离子液体种类[C4MIM][Br]、[C6MIM][Br]、[C8MIM][Br]、[C10MIM][Br]和[C12MIM][Br]对5种木脂素提取率的影响。结果见图2。

图2 离子液体种类对提取率的影响

由图2可知，在离子液体种类考察范围内，随着离子液体烷烃链的延长，5种木脂素类成分的提取率呈增长趋势，当使用[C12MIM][Br]为提取溶剂时，各成分含量最高，故确定最佳离子种类为[C12MIM][Br]。

2.3.2 离子浓度对提取效果的影响 取五味子粉末0.2 g，精密称定，以[C12MIM][Br]为提取溶剂，准确加入不同浓度离子液体溶液4 mL，在30 ℃下超声30 min，离心10 min(4000 r·min-1)，滤过(0.2 μm)，按2.1项下的色谱条件进行测定，采用外标两点法计算各样品中木脂素的含量，考察离子浓度分别为0.2、0.4、0.8、1.0、1.2 mol·L-1时，对5种木脂素类成分提取率的影响。结果见图3。

注：五味子乙素采用右侧坐标轴，其余采用左侧坐标轴。图3 离子液体浓度对提取效果的影响

由图3可知，随着离子液体浓度的增大，各木脂素的提取率曲线整体呈先增长后平缓的趋势，在浓度为0.4 mol·L-1时，各木脂素提取率最高，因此确定最佳离子液体浓度为0.4 mol·L-1。

2.3.3 料液比对提取效果的影响 取五味子粉末0.2 g，精密称定，以0.4 mol·L-1的[C12MIM][Br]为提取溶剂，准确加入不同料液比的该溶剂，在30 ℃下超声30 min，离心10 min(4000 r·min-1)，滤过(0.2 μm)，按2.1项下的色谱条件进行测定，采用外标两点法计算各样品中木脂素的含量，考察料液比分别为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40和1∶50时，对5种木脂素提取率的影响。结果见图4。

注：五味子酯甲采用右侧坐标轴，其余采用左侧坐标轴。图4 料液比对木脂素类成分的影响

由图4可知，除五味子酯甲外，剩余的4种成分的提取率变化均先增长后平缓趋势，当料液比为1∶30时，五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素和五味子总木脂素均达到最大值，由于五味子酯甲含量提取率较低，对于总木脂素提取率影响不明显，故选择最佳料液比为1∶30。

2.3.4 温度对提取效果的影响 取五味子粉末0.2 g，精密称定，准确加入0.4 mol·L-1的[C12MIM][Br]6 mL，在不同温度下超声30 min后，离心10 min(4000 r·min-1)，滤过(0.2 μm)，按2.1项下的色谱条件进行测定，采用外标两点法计算各样品中木脂素的含量，考察提取温度分别为20、30、40、50、60 ℃时，对5种木脂素提取率的影响。结果见图5。

注：五味子酯甲采用右侧坐标轴，其余采用左侧坐标轴。图5 提取温度对提取效果的影响

由图5可知，从整体趋势上，温度变化对5种木脂素类成分的提取效果无明显影响。但也可以观察到温度从20 ℃变化至30 ℃时，各木脂素类成分的提取率微呈上升趋势；而30 ℃升高到60 ℃时，各成分提取率趋势无明显变化；因此，确定最佳提取温度为30 ℃。

2.3.5 提取时间对提取效果的影响 取五味子粉末0.2 g，精密称定，准确加入0.4 mol·L-1的[C12MIM][Br]溶液6 mL，在30 ℃下，超声不同时间后，离心10 min(4 000 r·min-1)，滤过(0.2 μm)，按2.1项下的色谱条件进行测定，采用外标两点法计算各样品中木脂素的含量，考察提取时间为10、20、30、40、50 min对5种木脂素提取率的影响。结果见图6。

注：五味子酯甲采用右侧坐标轴，其余采用左侧坐标轴。图6 提取时间对提取效果的影响

由图6知，在考察时间范围内，5种木脂素提取率曲线变化平缓，为提高效率，选择10 min为最佳提取时间。

2.3.6 验证实验结果 综上所述，确定五味子木脂素的最佳提取工艺：离子液体种类[C12MIM][Br]，离子液体浓度0.4 mol·L-1，温度30 ℃，提取时间10 min，料液比1∶30，提取效果最佳。五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子总木脂素含量的RSD值均小于5%。结果见表3。

表3 验证实验 %

2.4 不同方法提取五味子中5种木脂素类成分的比较

采取超声提取法(《中华人民共和国药典》法)[9]和回流提取法[15]对五味子木脂素进行提取，将实验结果与离子液体超声提取结果进行比较。

2.4.1 超声提取法(药典法) 取五味子粉末0.25 g，精密称定，加入甲醇20.0 mL，称定重量。在室温条件下超声(功率100 W，频率20 kHz)处理20 min，放冷，补足减失重量，滤过(0.2 μm)，按2.1项的色谱条件测定，采用外标两点法计算各样品中木脂素的含量。结果见表4。

2.4.2 回流提取法 精密称取五味子药材粉末1 g，加入80%乙醇12.0 mL，回流提取两次，每次提取3 h，合并两次续滤液，转移至25 mL量瓶中，用80%乙醇定容至刻度，摇匀，滤过(0.2 μm)，按2.1项的色谱条件测定，采用外标两点法计算各样品中木脂素的含量。结果见表4。

表4 3种提取方法比较 %

2.4.3 不同提取方法结果比较 由表4可知，离子液体超声提取法的提取效果与超声提取法和回流法的提取效果相近，但其提取时间短，仅需10 min，可快速提取五味子中木脂素成分，且所用离子液体绿色环保，可重复利用。

3 讨论

有效成分提取效率受到溶剂种类、粘度、料液比和温度等多种因素的影响。本研究中采用的离子液体其极性随着阴离子烷基链的增长而减小，其粘度与离子液体浓度呈一定正相关关系。而本文中的5种木脂素为联苯环辛二烯类，故选择浓度为0.4 mol·L-1的[C12MIM][Br]为宜。适宜的料液比能够增大有效成分提取率，为减少溶剂回收工作量，所以确定最佳料液比为1∶30。提高温度可加快分子热运动，由温度-提取率曲线得出，30 ℃提取效果好。本研究发现，提取时间对木脂素提取效率无明显影响，故选择10 min。

Ma等[16]报道了以0.8 mol·L-1的[C12MIM][Br]离子液体水溶液为提取溶剂，料液比为1∶12，浸泡4.0 h后，超声提取3次，每次30 min，五味子中木脂素的提取效果是回流提取的3.5倍。本研究采用0.4 mol·L-1的[C12MIM][Br]离子液体水溶液为提取溶剂，料液比为1∶30，在温度30 ℃下，超声10 min，五味子中木脂素的提取效果与回流法提取效果相当。

在实验过程中，作者发现当[C12MIM][Br]的浓度大于0.6 mol·L-1时，离子液体粘度过大，不易溶于水中，且对色谱柱造成污染，需对样品溶液稀释后进样。

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IonicLiquid-BasedUltrasonic-AssistedExtractionofLignansfromFruitofSchisandrachinensis(Turcz.)Baill.

ZHANG Jidan1，2，LI Hua1，2*，KE Huaxiang1，3，SHAO Aijuan1，2，YANG Bin1，2

(1.InstituteofChineseMateriaMedica，ChinaAcademyofChineseMedicalSciences，Beijing100700，China；2.StateKeyLaboratoryBreedingBaseofDao-diHerbs，ChinaAcademyofChineseMedicalSciences，Beijing100700，China；3.SchoolofFoodandBioengineering，XiHuaUniversity，Chengdu610039，China)

Objective：To optimize the extraction technique of lignans fromSchisandrachinensis，using ionic liquid-based ultrasonic-assisted extraction (ILUAE).Methods：Different cations and concentration of ionic liquid，solid-liquid ratio，extraction temperature and time for ultrasonic treatment were optimized by single factor experiments in order to increase the content of schisandrin，schisandrol B，schisantherin A，deoxyschisandrin，schisandrin B.Moreover，heat-reflux extraction and ultrasonic-assisted extraction were also experimented forthe comparison.Results：The optimized operational variables of ILUAE were obtained as follows：[C12MIM]Br concentration 0.4 mol/L was selected as solvent，solid-liquid ratio was 1∶30 (m/v)，ultrasonic treatment lasted for 10 min under the temperature 30 ℃.Conclusion：ILUAE is convenient and rapid，and can be used to extract lignans fromS.chinensis.

Ionic liquid；Schisandrachinensis(Turcz.)Baill；lignans；extraction

国家中医药管理局中医药行业科研专项(201407003)

] 李化，博士，副研究员，研究方向：中药化学与质量评价、元素的形态分析；Tel：(010)64014411-2848，E-mail：lihua1976@icmm.ac.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.5.022

2017-07-11)

*[