UPLC-MS同时测定蒙药材蓝刺头中6个成分的含量△

麻剑南，马超美，田志杰，刘卫东*

(1.内蒙古盛唐国际蒙医药研究院有限公司，内蒙古 呼和浩特 010010；2.内蒙古大学 生命科学学院，内蒙古 呼和浩特 010021；3.内蒙古大唐药业股份有限公司，内蒙古 呼和浩特 010010)

·基础研究·

UPLC-MS同时测定蒙药材蓝刺头中6个成分的含量△

麻剑南1，马超美2，田志杰3，刘卫东1*

(1.内蒙古盛唐国际蒙医药研究院有限公司，内蒙古 呼和浩特 010010；2.内蒙古大学 生命科学学院，内蒙古 呼和浩特 010021；3.内蒙古大唐药业股份有限公司，内蒙古 呼和浩特 010010)

目的：建立超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS)同时测定蒙药材蓝刺头中绿原酸、1，5-二咖啡酰奎宁酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸、芹菜素和芹菜素-7-O-葡萄糖苷含量的方法。方法：样品分析采用Agilent 6430液质联用仪；色谱柱为Agilent ZORBAX RRHD Ecilipse Plus-C18；流动相为0.1%甲酸水溶液-甲醇，梯度洗脱；离子源为电喷雾电离源(ESI)；采用负离子多反应监测模式(MRM)。结果：绿原酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、1,5-二咖啡酰奎宁酸、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、4,5-二咖啡酰奎宁酸和芹菜素分别在1.25～40.00(r=0.999 0)、0.94～30.00(r=0.999 8)、0.94～30.00(r=0.999 8)、0.16～5.00(r=0.999 7)、0.16～5.00(r=0.999 9)、0.02～2.50(r=0.999 5)μg·mL-1线性关系良好；加样回收率为99.80%～102.97%，RSD为1.23%～2.98%。结论：该方法专属性强、精密度高、重复性好，为蒙药材蓝刺头的成分研究提供科学参考。

蓝刺头；绿原酸类；黄酮类；超高效液相色谱-串联质谱法；含量测定

蓝刺头EchinopslatifoliusTausch.为菊科蓝刺头属植物，为中药禹州漏芦的基原植物之一，其干燥根具有清热解毒、消痈、下乳、舒筋通脉的功能[1]。而其干燥头状花序则为常用蒙药，名为“蓝刺头”，蒙药名“乌日格斯图-呼和”，具有固骨质、接骨愈伤、清热解痛的功效[2-4]。中药材禹州漏芦化学成分和药理作用较明确[5-7]，并已被2015版《中华人民共和国药典》收录。入药部位不同的蒙药材蓝刺头，被《内蒙古蒙药材标准》、《中华本草·蒙药卷》、《中华人民共和国卫生部药品标准·蒙药分册》收录，尚未被《中华人民共和国药典》收录，且还未见相关成分含量测定的研究报道。

本研究首次利用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS)技术，对蓝刺头的6个化学成分绿原酸、1，5-二咖啡酰奎宁酸(1，5-DCQA)、3，5-二咖啡酰奎宁酸(3，5-DCQA)、4，5-二咖啡酰奎宁酸(4，5-DCQA)、芹菜素和芹菜素-7-O-葡萄糖苷进行了含量测定，其中3个二咖啡酰奎宁酸类成分为首次在蓝刺头中报道。本研究旨在借助现代技术，为明确蓝刺头的成分和提升民族药材的质量标准研究奠定科学基础。

1 材料与仪器

1.1 试药

蒙药材蓝刺头分别购自安国市义通中药材有限公司(批号：20150906，产地：河北)和济南人和中药饮片有限公司(批号：20140205，产地：内蒙古)，经内蒙古盛唐国际蒙医药研究院有限公司张树森教授鉴定为菊科蓝刺头EchinopslatifoliusTausch.的干燥花序。

对照品绿原酸(批号：NO.15082721)、3，5-二咖啡酰奎宁酸(批号：NO.15111925)，4，5-二咖啡酰奎宁酸(批号：NO.15081422)、芹菜素-7-O-葡萄糖苷(批号：NO.15062321)购自上海同田生物技术股份有限公司，1，5-二咖啡酰奎宁酸(北京世纪奥科生物技术有限公司，批号：15080115)，芹菜素(中国食品药品鉴定研究院，批号：111901-201102)，6个对照品纯度均大于98%；甲醇为色谱纯；其他试剂均为分析纯；水为纯化水。

1.2 仪器

超高效液相色谱-四极杆质谱联用仪(UPLC-MS)：分析用Agilent 1290 infinity UPLC系统，连接有6430三级串联四极质谱检测器[Agilent Technologies Sin-78，Singapore(International)Pte.Ltd.，新加坡]；FDU-1200型冷冻干燥机(-45 ℃)(上海爱郎仪器有限公司)；QE-100 g中药粉碎机(浙江屹立工贸有限公司)；JP-100/S型超声波清洗机(深圳洁盟清洗设备有限公司)；SC-04型低速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)；TB-25型分析天平(美国Denver公司)。

2 方法与结果

2.1 色谱和质谱条件

Agilent ZORBAX RRHD Ecilipse Plus-C18色谱柱(50 mm ×2.1mm，1.8 μm)；流动相：0.1%甲酸水溶液(A)-甲醇(B)。梯度洗脱(0～3 min，18%～22% B；3～3.5 min，22%～25% B；3.5～15 min，25% B；15～17 min，25%～45% B；17～18 min，45%～80% B；18～20 min，80%～100%B);柱温：30℃；流速：0.4 mL·min-1；进样量：2μL；负离子多反应监测模式(MRM)；电喷雾(ESI)离子源；干燥气温度：350 ℃，氮气流速：11L·min-1，喷雾器压力45 Psi(1 Psi=6.895 kPa)，毛细管电压：3.5 kV。UPLC-MS优化结果见表1，混合对照品及供试品色谱图见图1。

2.2 对照品溶液的制备

分别精密称定绿原酸、1，5-DCQA、3，5-DCQA、4，5-DCQA、芹菜素和芹菜素-7-O-葡萄糖苷对照品适量，加无水乙醇，分别制成1.0 mg·mL-1的贮备溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备

取冷冻干燥后的蓝刺头药材，粉碎处理过4号筛，称取20 mg药粉，置50 mL具塞锥形瓶中，精密加入60%乙醇水溶液10 mL。超声提取30 min(10 min/次)(500 W，40 kHz)，转移至15 mL离心管中，离心取上清液(4000 r·min-1，2433×g，3 min)，0.22 μm微孔滤膜滤过，取滤液，备用。

表1 MRM模式下6个对照品的UPLC-MS优化结果

注：A.6个对照品；B.河北产蓝刺头；C.内蒙古产蓝刺头；1.绿原酸；2.3，5-二咖啡酰奎宁酸；3.1，5-二咖啡酰奎宁酸；4.芹菜素-7-O-葡萄糖苷；5.4，5-二咖啡酰奎宁酸；6.芹菜素。图1 MRM模式下蓝刺头中6个成分的UPLC-MS色谱图

2.4 线性关系考察

精密配制6个对照品的混合对照品溶液，过程如下：精密量取6个对照品贮备溶液适量，加60%乙醇水溶液稀释，即得最高质量浓度混合对照品溶液(L10)。然后，用60%乙醇水溶液将混合对照品溶液L10以1∶2∶2∶2∶2∶2∶2∶2∶2∶2的比例稀释10个梯度，即得10个质量浓度的混合对照品溶液(L10～L1)。最后，择优选取6个质量浓度对照品溶液，用于标准曲线的绘制。以峰面积为纵坐标(Y)，质量浓度为横坐标(X)作线性回归，结果见表2。

2.5 精密度试验

取同一混合对照品对照品溶液，按2.1项条件连续测定6次，测得绿原酸、1，5-DCQA、3，5-DCQA、4，5-DCQA、芹菜素和芹菜素-7-O-葡萄糖苷的峰面积RSD(n=6)分别为0.4%、0.4%、0.3%、0.4%、0.6%、0.5%，表明仪器精密度良好。

表2 蓝刺头中6个成分的线性回归分析结果

2.6 稳定性试验

取同一供试品溶液，按2.1项条件分别在0、2、4、6、8、10、14、18、24 h进样测定。计算绿原酸、1，5-DCQA、3，5-DCQA、4，5-DCQA、芹菜素和芹菜素-7-O-葡萄糖苷的峰面积RSD(n=9)分别为0.6%、1.1%、0.4%、1.2%、1.7%、1.3%，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

2.7 重复性试验

取同一批号(20140205)蓝刺头药材，按2.3项平行制备6份供试品溶液，按2.1项条件测定。计算绿原酸、1，5-DCQA、3，5-DCQA、4，5-DCQA、芹菜素和芹菜素-7-O-葡萄糖苷的峰面积RSD(n=6)分别为2.1%、2.5%、1.9%、2.2%、2.3%、1.6%，表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率

精密称取同一批号(20140205)已知含量的蓝刺头样品6份，分别准确加入一定量的2.2项中对照品贮备溶液(1.0 mg·mL-1)，按2.3项制备供试品溶液，测定6个化合物的峰面积，计算回收率，结果见表3。

2.9 样品含量测定

分别取两批次的不同产地蓝刺头药材各6份，同法测定样品中6个成分的含量，结果见表4。

表3 蓝刺头中6个成分的加样回收率试验结果(n=6)

表3(续)

表4 蓝刺头中6个成分的含量测定(n=6) mg·g-1

3 讨论

本研究首次利用UPLC-MS技术对蒙药材蓝刺头的6个化学成分进行了含量测定，并首次在该药材中发现含有3个二咖啡酰奎宁酸类化合物，分别是1，5-二咖啡酰奎宁酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸和4，5-二咖啡酰奎宁酸。近年来的研究结果显示，绿原酸类化合物具有诸多的药理活性[8]，特别是在抗病毒[9]、抗氧化[10]、抑制胰腺脂酶[11]等方面效果显著，故预测蒙药材蓝刺头具有潜在的多重药理活性，该研究结果为蒙药材蓝刺头的应用提供了理论参考。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部 [S].北京：中国医药科技出版社，2015：260-261.

[2] 内蒙古自治区卫生厅.内蒙古蒙药材标准 [S].1986：501-502.

[3] 国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草·蒙药卷 [S].上海：上海科学技术出版社，2004：382-385.

[4] 中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准·蒙药分册 [S].1998：51.

[5] 张冬艳，杨雷，薛培凤，等.药用植物蓝刺头的研究进展 [J].中国药师，2015，18(11)：1966-1971.

[6] 胡伊力格其.HPLC法测定民族药材禹州漏芦不同部位中绿原酸的含量 [J].中国民族医药杂志，2015，3(3)：55-56.

[7] 杨斌，萨茹丽，刘敏，等.蓝刺头花絮水提物的降血糖作用研究 [J].西北农林科技大学学报(自然科学版)，2015，43(5)：1-5.

[8] 刘颖，郭明晔，白根本.绿原酸的研究进展 [J].中药材，2012，35(7)：1180-1185.

[9] Wang G F，Shi L P，Ren Y D，et al.Anti-hepatitis B virus activity of chlorogenic acid，quinic acid and caffeic acidinvivoandinvitro[J].Antiviral Res，2009，83(2)：186-190.

[10]Xu J G，Hu Q P，Liu Y.Antioxidant and DNA-protective activities of chlorogenic acid isomers [J].J Agric Food Chem，2012，60(46)：11625-11630.

[11]Cha K H，Song D G，Kim S M，et al.Inhibition of gastrointestinal lipolysis by green tea，coffee，and gomchui(Ligulariafischeri)tea polyphenols during simulated digestion [J].J Agric Food Chem，2012，60(29)：7152-7157.

SimultaneousDeterminationofSixCompoundsinEchinopslatifoliusTausch.FlowersbyUPLC-MS

MAJiannan1，MAChaomei2，TIANZhijie3，LIUWeidong1*

(1.InnerMongoliaShengTangMongolianMedicineResearchInstituteCo.，Ltd.,Hohhot010010，China；2.CollegeofLifeSciences，InnerMongoliaUniversity，Hohhot010021，China；3.InnerMongoliaGrandPharmaceuticalCo.，Ltd.,Hohhot010010，China)

Objective：To develop a specific UPLC-MS method for the determination of chlorogenic acid，1，5-dicaffeoylquinic acid，3，5-dicaffeoylquinic acid，4，5-dicaffeoylquinic acid，apigenin，and apigenin-7-O-glucoside in the flowers ofEchinopslatifoliusTausch..Methods：By using the UPLC-MS method，the six compounds were separated on an Agilent ZORBAX RRHD Ecilipse Plus-C18column with a mobile phase consisted of water containing 0.1% formic acid and methanol with gradient elution.Electrospray ionization source was applied and operated in negative ionization multiple reaction monitoring model(MRM).Results：The linear ranges of chlorogenic acid，3，5-dicaffeoylquinic acid，1，5-dicaffeoylquinic acid，apigenin-7-O-glucoside，4，5-dicaffeoylquinic acid，and apigenin were 1.25-40.00(r=0.999 0)，0.94-30.00(r=0.999 8)，0.94-30.00(r=0.999 8)，0.16-5.00(r=0.999 7)，0.16-5.00(r=0.999 9)，0.02-2.50(r=0.999 5) μg·mL-1，respectively.The recoveries of six analytes ranged from 99.80% to 102.97%，and the relative standard deviations were in the range of 1.23% to 2.68%.Conclusion：The method is sensitive，accuracy and suitable for the determination of main compounds in the flowers ofE.latifolius.

Echinopslatifolius；chlorogenic acids；flavonoids；UPLC-MS；quantification

呼和浩特市重大科技专项(2014150103000169)

] 刘卫东，制药高级工程师，研究方向：新药研发；Tel：(0471)4611140，E-mail：weidliu@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.4.008

2016-07-11)

*[