液质联用鉴定单面针中的化学成分△

宛玉祥，李家宇，秦优，周卿意骏，蔡萍，张水寒*

(1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410006；2.湖南中医药研究院，湖南 长沙 410005)

·基础研究·

液质联用鉴定单面针中的化学成分△

宛玉祥1，2，李家宇1，2，秦优1，2，周卿意骏1，2，蔡萍2，张水寒2*

(1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410006；2.湖南中医药研究院，湖南 长沙 410005)

目的：利用LC-MS分析技术快速鉴定单面针中的生物碱结构。方法：采用XAqua C8色谱柱(150 mm×2.1 mm，5 μm)；以乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相梯度洗脱；体积流量：0.3 mL·min-1；ESI源正离子模式检测；根据对照品的裂解规律和参考文献推测生物碱的结构。结果：从单面针的甲醇提取物中鉴定了20个化合物结构。结论：LC-MS方法能快速、准确地鉴定单面针中的化学成分，为单面针活性成分的开发利用提供科学依据。

单面针；生物碱

单面针ZanthoxylumdissitumHemsl.为芸香科花椒属植物蚌壳花椒，别名山枇杷、山椒根、黄椒根等[1]，主要分布于我国西南部、广东、广西等地，生长于山地林中，有祛风通络、消肿止痛等作用，为民间常用的消肿止痛中药。近代研究表明单面针主要活性成分是生物碱，目前发现的生物碱[2]主要为白鲜碱、茵芋碱、花椒碱、血根碱、两面针碱。国内外对花椒属植物研究主要集中在两面针，单面针作为其同属植物的野生资源现代研究较少，但是单面针在民间长期使用。因此，有必要对单面针中化学成分进行研究。LC-MS技术由于其高分辨率、高灵敏度的分析特点，已广泛运用到中药药效物质基础、中药化学成分分析等领域的研究。本研究采用LC-MS对单面针中的生物碱结构进行鉴定，为其化学成分的进一步研究、药效物质基础的阐明和单面针的开发应用提供科学依据。

1 仪器与试剂

1290 HPLC串联6530 Q-TOF/MS(美国Agilent公司)；ML 204/02型精密天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]。

乙腈、甲酸、甲醇(色谱纯，Merck)；水为Milli-Q超纯水；去甲乌药碱对照品(上海永恒科技有限公司,批号：H1-111859，纯度：98%)；白鲜碱对照品(批号：110851-200504)、白屈菜红碱对照品(批号：111718-200501)购自中国食品药品检定研究院，别隐品碱对照品(Sigma公司，批号：s450987，纯度：98%)；s-reticuline对照品(TRC公司，批号：14-SDJ-121-1，纯度：98%)；木兰箭毒碱对照品(实验室自制，纯度：98%)。

单面针采自国家中药材生产(湖南)技术中心基地，经湖南中医药大学杨广民教授鉴定为单面针ZanthoxylumdissitumHemsl.。

2 方法

2.1 样品的制备

取1.0 g单面针根部干燥粉末于150 mL锥形瓶中，加入50 mL甲醇超声提取60 min，过滤，滤液过0.22 μm微孔滤膜，待用。

2.2 色谱条件

Agilent 1290液相色谱仪，色谱柱：XAquaC8柱(150 mm×2.1 mm，5 μm)；流动相A为0.1%甲酸-水，流动相B为乙腈；洗脱条件：0～30 min，2%～45% B；30～50 min，45%～90% B；流速为0.3 mL·min-1；检测波长为272 nm；进样量为1 μL；柱温为30 ℃。

2.3 质谱条件

ESI离子源，采用正离子检测模式，干燥器温度300 ℃，干燥气体积流量：8 L·min-1，雾化器压力：3.8×106Pa，脱溶剂温度350 ℃，脱溶剂气体积流量：12 L·min-1，毛细管电压：3500 V，锥孔电压：100 V，扫描范围m/z120～1200，二级裂解电压15～35 eV。

3 结果与讨论

本实验运用HPLC-Q-TOF/MS对单面针甲醇提取物进行分析鉴定，总离子流图见图1，选择80余个峰进行二级质谱分析，最终推断出20个生物碱结构，其特征性二级质谱数据见表1。

图1 单面针甲醇提取物HPLC-Q-TOF/MS的总离子流图

峰序t/min[M]+或[M+H]+(m/z)特征离子MS/MS(m/z)推断化合物名称15.550180.1381180,1212-(4-methoxyphenyl)-N,N-dimethylethanaminium25.942180.1025180,162,135,107朗吉码胺36.618408.1216408,246,230,202苷帕林48.337596.2334596,434,272,255,1074'-glucosulfonyl-6,7-dihydroxy-benzyltetrahydroisoquinoline59.239434.1812434,272,255,1074'-glucosyl-6,7-dihydroxy-benzyltetrahydroisoquinoline611.701476.2272476,314,269,1074'-glucosyl-6-hydroxy-7-methoxyl-N,N-dimethyltetra-hydroisoquinoline714.380314.1748314,269,175,107Isoliensinine(异莲心碱)815.700344.1859344,299,175,137tembetarine(N-甲基网叶番荔枝碱)916.142272.1283272,255,107去甲乌药碱1016.384328.1912328,313,283,1074'-hydroxy-6,7-dimethoxyl-N,N-dimet-hyltetrahydroiso-quinoline1118.046342.1700342,297,265,237木兰花碱1219.826314.1756314,269,192,107木兰箭毒碱1321.437370.1648370,206,165,149别隐品碱1423.741348.1228348,332,302两面针碱1524.276348.1239348,333,318,304,290Chelerythrinechloride(白屈菜红碱)1630.105246.0765246,231,216,188去甲茵芋碱1731.466260.0915260,244,230,216茵芋碱1833.061230.0811230,215,200花椒碱1934.230200.0695200,185,157Dictamnine(白鲜碱)2035.265246.0765246,230,202拟芸香品碱

3.1 苄基异喹啉类生物碱

苄基异喹啉类生物碱易失去NH3、CH3NH2或者(CH3)2NH，从而形成[M-17]+、[M-31]+或者[M-45]+的碎片峰，接着只有部分取代基从母核上丢失，形成m/z107、137、151的碎片峰，相应的氮原子没有丢失形成一个偶数的碎片峰。如对照品S-网脉番荔枝碱、去甲乌药碱、木兰箭毒碱的特征碎片离子峰符合这一裂解规律(对照品二级质谱图、裂解途径见图2)。据此推断化合物4、5、6、7、8、9、10、12为苄基异喹啉类。

注：a.S-reticuline；b.去甲乌药碱;c.木兰箭毒碱。图2 S-reticuline、去甲乌药碱、木兰箭毒碱质谱裂解途径

化合物4和5的特征碎片中失去一分子或两分子葡萄糖后的特征碎片峰与去甲乌药碱裂解相似，参考文献[3]，推定化合物4为4′-glucosulfonyl-6,7-dihydroxybenzyltetrahydroisoquinoline，化合物5为4′-glucosyl-6,7-dihydroxybenzyltetrahydroisoquinoline。化合物9与对照品去甲乌药碱二级碎片相同，推定为去甲乌药碱。季铵型苄基异喹啉生物碱与对照品木兰箭毒碱裂解相似，首先失去(CH3)2NH形成M-45的子离子，苄基断裂产生m/z151、137、107的碎片峰，不同的碎片峰相应的取代基不同。若相邻的两个甲氧基会失去CH4形成M-16的碎片峰，相邻为甲氧基和羟基会失去CH3OH形成M-32的碎片峰，相邻位置为两个羟基一般不发生裂解。若化合物是生物碱苷会先失去葡萄糖形成相应的苷元子离子特征峰，接着与对照品木兰箭毒碱裂解相似。综上所述，参考文献[4-6]，推定化合物6为4′-glucosyl-6-hydroxy-7-methoxyl-N,N-dimethyltetrahydroisoquinoline，化合物7为异莲心碱，化合物8为tembetarine，化合物10为4′-hydroxy-6,7-dimethoxyl-N,N-dimethyltetrahydroisoquinoline，化合物12为木兰箭毒碱。

3.2 呋喃喹啉类生物碱

呋喃喹啉类生物碱母核较稳定，主要是取代基发生断裂形成M-CH3、M-CH3-CO的碎片离子。如对照品白鲜碱符合这一裂解规律(对照品二级质谱图、裂解途径见图3)，推断化合物3、16、17、18、19、20为呋喃喹啉类生物碱。

化合物3接有葡萄糖基会形成[M-C6H10O5]+碎片离子，接着与该类化合物裂解相似。化合物存在甲氧基会形成[M-CH3]+继而形成[M-CH3-CO]+的碎片离子，相邻的甲氧基会形成M-16的碎片峰，相邻的甲氧基和羟基会形成M-32的碎片峰。参考文献[7-8]，推定化合物3为苷帕林，化合物16为去甲茵芋碱，化合物17为茵芋碱，化合物18为花椒碱，化合物19为白鲜碱，化合物20为拟芸香品碱。

3.3 其他类型生物碱

化合物13和15与对照品别隐品碱和白屈菜红碱保留时间和二级碎片峰相同，推定化合物13为别隐品碱，化合物15为白屈菜红碱(对照品二级质谱图见图4)。参考文献[9]，化合物1苄基断裂失去(CH3)3N形成m/z121的碎片峰，推定为2-(4-methoxyphenyl)-N，N-dimethylethanaminium；化合物2发生RDA裂解产生m/z137的碎片峰,接着失去醛基产生m/z107的碎片峰，推定为朗吉码胺；化合物11、14为同属植物两面针中报道的结构，推定化合物11为木兰花碱，化合物14为两面针碱。

图3 白鲜碱质谱裂解途径

图4 白屈菜红碱和别隐品碱质谱图

4 结论

本文运用LC-MS对单面针中化学成分进行分析，通过对照品裂解规律和对比文献推断了20个生物碱结构，其中有较多的生物碱在单面针中首次发现，对单面针中化学成分分离纯化具有重要的指导作用。HPLC-Q-TOF/MS具有快速、准确等特点，对于天然产物复杂体系中活性成分的初步定性研究具有重要的意义。研究发现单面针中存在很多微量生物碱，大多数生物碱与两面针相似。运用LC-MS对单面针中化学成分进行鉴定，对研究开发以单面针为原料的产品具有重要意义。

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IdentificationofChemicalIngredientinZanthoxylumdissitumHemsl.byLC-MS

WANYuxiang1,2，LIJiayu1,2,QINYou1,2，ZHOUQingyijun1,2,CAIPing1,2,ZHANGShuihan2*

(1.HunanUniversityofChineseMedicine,Changsha410006,China;2.HunanAcademyofChineseMedicine,Changsha410005,China)

Objective：To rapidly identify alkaloids inZanthoxylumdissitumHemsl.using the LC-MS.Methods：The separation was performed on a XAqua C8column(150 mm×2.1 mm，5 μm)with acetonitrile-0.1% formic in water by gradient elution.The flow rate was 0.3 mL·min-1.Electrospray ionization-(ESI)source was applied and operated in positive ion mode.The structure of alkaloids was speculated by MS/MS fragmentation behaviors of standards and related references.Results：20 alkaloids were elucidated from the methanolic extracts ofZ.dissitum.Conclusion：It is a rapid and reliable method to identify the alkaloids inZ.dissitumby LC-MS.The result would provide scientific evidence for development and utilization and study of pharmacodynamic material basis in this plants.

ZanthoxylumdissitumHemsl.；alkaloids

湖南省科技厅项目(2016JJ4055)

] 张水寒，研究员，研究方向：中药资源、制剂及质量；E-mail：zhangshuihan0220@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.4.005

2016-09-08)

*[