UPLC-MS/MS测定不同产地吊石苣苔中苯乙醇苷类成分含量△

张瑜，杨健，詹志来，胡峻，刘勇*，袁媛

(1.北京中医药大学 中药学院，北京 100102；2.道地药材国家重点实验室培育基地，中国中医科学院 中药资源中心，北京 100700)

·基础研究·

UPLC-MS/MS测定不同产地吊石苣苔中苯乙醇苷类成分含量△

张瑜1，2，杨健2，詹志来2，胡峻1，刘勇1*，袁媛2

(1.北京中医药大学 中药学院，北京 100102；2.道地药材国家重点实验室培育基地，中国中医科学院 中药资源中心，北京 100700)

目的：建立超高效液相色谱三重四极杆串联质谱法(UPLC-MS/MS)同时测定不同产地吊石苣苔中4个苯乙醇苷类成分的方法，分析比较不同产地吊石苣苔中苯乙醇苷含量差异。方法：采用 ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(100 mm ×2.1 mm，1.8 μm)；以 0.1%甲酸-水(A)- 0.1%甲酸-乙腈(B)溶液为流动相，梯度洗脱，体积流量为 0.5 mL·min-1；柱温为40 ℃，采用电喷雾离子源，负离子检测方式，得到相应的提取离子流图。结果：不同产地吊石苣苔中4个苯乙醇苷含量有明显差异，结论：该方法操作简便、准确、重复性好，对寻找高含量苯乙醇苷的资源植物及产地具有重要的理论指导意义。

吊石苣苔；苯乙醇苷；UPLC-MS/MS

吊石苣苔LysionotuspauciflorusMaxim.为苦苣苔科(Gesneriaceae)吊石苣苔属(Lysionotus)草本植物，别名石豇豆、石泽兰、岩豇豆、岩石茶、岩头三七等[1-2]，近代研究表明其具有抗结核杆菌、抗炎、抗肝毒，祛痰、平喘镇静，降血压、降血脂、抗动脉粥样硬化、清除自由基、抗肿瘤作用和提高机体免疫功能等多种活性作用[3]，苯乙醇苷(phenylethanoid glycosides)是广泛存在于玄参目和唇形目等较进化的双子叶植物类群(如爵床科、列当科、苦苣苔科、唇形科和马鞭草科)中的一类活性成分，有些文献[4]也称苯丙素苷类化合物(phenylpropanoid glycosides)，该类化合物具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、免疫调节、增强记忆、保肝、强心等作用[5]。课题组前期工作表明，吊石苣苔中含有阿克苷和极为少见的paraboside Ⅲ等苯乙醇苷类成分[6]，本研究以另外4个苯乙醇苷类化合物作为对照品，以湖南、云南、四川、重庆4个产地13个吊石苣苔为实验样本，采用UPLC-MS/MS测定样本中4个苯乙醇苷的含量，对探究苯乙醇苷含量较高的吊石苣苔产地分布规律有一定理论指导意义。

1 材料与仪器

1.1 材料

苯乙醇苷类对照品共4个，分别是isonuomioside A、paraboside B、nuomioside A、paraboside A，为实验室自制，纯度均大于95%。对照品化学结构见图1。

注：1.isonuomioside A；2.paraboside B；3.nuomioside A；4.paraboside A。图1 苯乙醇苷类化合物的化学结构

1.2 植物

2013年8月从湖南、云南、四川、重庆4个地方采集到13个吊石苣苔样品，并由中国科学院北京植物研究所李振宇研究员鉴定为吊石苣苔LysionotuspauciflorusMaxim.。样品标本保存于北京中医药大学，样品信息见表1。

表1 吊石苣苔样品采集信息表

1.3 仪器和试剂

ACQUITY UPLCTM H-Class系统(美国Waters公司，包括四元高压梯度泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器、EmpowerTM3色谱工作站)，API 6500四极杆-线性离子阱质谱仪(美国ABSCIEX 公司，配有离子喷雾接口)，SB-800 DTD型超声波清洗器(宁波新芝生物科技股份有限公司)，New Classic MS-S电子天平[梅特勒-托利多(上海)有限公司]，Eppendorf 5810R离心机(德国Eppendorf 公司)。

色谱级甲醇和乙腈(美国Fisher Scientific公司)；甲酸(LC/MS分析用，美国Fisher Scientific公司)；水为屈臣氏蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 分析条件

2.1.1 色谱条件 ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(100 mm ×2.1mm，1.8 μm)，流动相：0.1%甲酸-水溶液(A)，0.1%甲酸-乙腈(B)；按程序梯度洗脱(0 min，15% B；1 min，20.5% B；4 min，21.5% B)；流速为0.6 mL·min-1，柱温为40 ℃，进样量为1 μL。对照品和样品的提取离子流图(XIC)见图 2、3。

注：A.nuomioside A；B.paraboside A；C.paraboside B；D.isonuomioside A。图2 对照品提取离子流图

2.1.2 质谱条件 离子源：Turbo V，电离模式：ESI-，气帘气(CUR)体积流量：30 L·min-1，喷雾电压(IS)：-4500 V，雾化气(GS1)体积流量：55 L·min-1，加热辅助气(GS2)体积流量：55 L·min-1，采集方式：MRM，离子化温度(TEMP)：550 ℃。优化的条件参数见表2。

注：A.nuomioside A；B.paraboside A；C.paraboside B；D.isonuomioside A。图3 吊石苣苔样品提取离子流图

化合物tR/minMRM参数MRM离子对(m/z)去簇电压(DP/V)碰撞能量(CE/eV)射出电压(CXP/V)isonuomiosideA1.81609.1/160.9-198-45-14parabosideB1.75741.1/579.0-267-49-49nuomiosideA1.38609.1/160.9-199-42-19parabosideA1.33741.2/579.1-279-45-49

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液的制备 精密称取样品细粉2.5 g，置于50 mL具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇水溶液[6]50 mL，称定质量，超声处理(功率 250 W，频率 40 kHz)1 h，称定重量，用70%甲醇水溶液[7]补足减少的质量，经0.22 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。放置于4 ℃冰箱供UPLC分析用。

2.2.2 混合对照品溶液制备 分别精密称取isonuomioside A、paraboside B、nuomioside A、paraboside A对照品适量，用甲醇配成单一成分对照品储备液。精密量取上述4种对照品溶液适量，加甲醇配制成每1 mL含isonuomioside A 519.4 μg、paraboside B 392.7 μg、nuomioside A 520.4 μg、paraboside A 497.3 μg的混合对照品溶液。放置于4 ℃冰箱供UPLC分析用。

2.3 线性关系考察

将上述混合对照品溶液进一步稀释成6个不同质量浓度的对照品溶液，按照2.1项下色谱条件测定峰面积。以进样质量浓度X(μg·mL-1)为横坐标，色谱峰面积Y为纵坐标分别得到回归方程：isonuomioside A，Y=2.079 2×106X-189 010(r=0.999 6)，线性范围0.166 ～ 259.68 μg·mL-1；paraboside B，Y=9.393 38×105X-214 846(r=0.999 4)，线性范围0.125 ～ 39.27 μg·mL-1；nuomioside A，Y=1.426 92×106X-293 390(r=0.999 8)，线性范围0.166～ 520.35 μg·mL-1；paraboside A，Y=9.587 86×106X-434 129(r=0.999 5)，线性范围0.159 ～ 49.77 μg·mL-1。

2.4 精密度试验

精密吸取同一混合对照品溶液连续进样6次，分别记录4个苯乙醇苷的峰面积和保留时间，计算其RSD在1.14%～1.88%；表明仪器精密度良好。

2.5 重复性试验

取同一样品5份，按照2.2.1项方法制备供试品溶液，进样测定，计算各苯乙醇苷成分质量分数的RSD值在1.77%～2.78%，表明方法重复性良好。

2.6 稳定性试验

取同一样品供试品溶液，分别在0、1、2、3、4、6、8 h 测定4个苯乙醇苷的峰面积,并计算其RSD值在 0.78%～3.76%，表明溶液在8 h内稳定性良好。

2.7 加样回收率试验

精密称取吊石苣苔样品9份，向其中加入高、中、低3个质量浓度(n=3)的对照品溶液。按照2.2项下方法处理后进样分析，每个浓度进行3次样本分析，以计算所得的实际值与加入量的比值即为其准确度。4个苯乙醇苷的平均加样回收率：isonuomioside A 为103.4%，paraboside B为97.5%，nuomioside A为98.5%，paraboside A为101.8%，其 RSD 均小于 2.9%。

3 样品测定

取13批样品，分别按照2.2.1项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件分析，以标准曲线法计算13批样品中4个苯乙醇苷类成分的质量分数，结果见表3。

表3 吊石苣苔中苯乙醇苷类成分质量分数(n=3) μg·mL-1

4 讨论

苯乙醇苷类化合物具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、免疫调节、增强记忆、保肝、强心等作用[5]，近年来逐步成为研究热点，本课题组前期研究表明，该类成分广泛存在于苦苣苔科植物中，本研究选用了4个苯乙醇苷类成分，其中isonuomioside A和paraboside B分别为咖啡酰基连在葡萄糖基6位的二糖苷和三糖苷，nuomioside A和paraboside A分别为咖啡酰基连在葡萄糖基4位的二糖苷和三糖苷；本实验结果表明，除了湖南省安化、四川省峨眉和重庆酉阳3个产地未检测到paraboside B，在其他产地的吊石苣苔中都检测到了4个苯乙醇苷类成分，说明这4个苯乙醇苷在吊石苣苔中普遍存在。

从不同产地分析，四川省汉源地区的吊石苣苔苯乙醇苷含量是所有地区中最高的，其中nuomioside A和isonuomioside A的含量分别高达0.78%和0.33%，与其相比，四川省其他地区样品中4个成分含量均较低，湖南省产的吊石苣苔从整体来看，4个苯乙醇苷含量比其他产地高，其中nuomioside A的含量均大于0.1%，isonuomioside A的含量除了湖南省安化的样品较低，其他地区均大于0.1%，而重庆和云南采的样品中，4个苯乙醇苷含量均较低。结果表明，不同产地吊石苣苔的苯乙醇苷含量存在较大差异。

nuomioside A和isonuomioside A在吊石苣苔中的含量表明这两个成分是吊石苣苔中重要的化学成分，目前2015版《中华人民共和国药典》中规定吊石苣苔的指标性成分为石吊兰素，且含量不低于0.1%[8]，鉴于苯乙醇苷类成分具有很好的活性且其在吊石苣苔中具有很高的含量，课题组后期工作可能会考虑为吊石苣苔中的苯乙醇苷类成分制订质量标准。

本实验的不足之处在于有的产地采集的样品太少，不能代表当地整体的吊石苣苔苯乙醇苷含量，今后还要进一步收集样品进行研究。

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[3] 王仕宝，晏继红，郭晓华，等.苗药石吊兰的研究进展[J].西北药学杂志，2014，29(5)：550.

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DeterminationofFourPhenylethanolGlycosidesinAerialPartsofLysionotuspauciflorusfromDifferentHabitatsbyUPLC-MS/MS

ZHANGYu1，2，YANGJian2，ZHANZhilai1，HUJun1，LIUYong1*，YUANYuan2

(1.BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100102,China；2.StateKeyLaboratoryofDao-diHerbsbreedingbase，NationalResourcesCenterforChineseMateriaMedica，ChinaAcademyofChineseMedicalSciences，Beijing100700，China)

Objective：To establish a UPLC-MS/MS method for the simultaneous determination of four phenylethanol glycosides in the aerial parts ofLysionotuspauciflorusMaxim.，and analyze and investigate the difference of phenylethanol glycosides ingredients in samples from different habitats.Methods：The determination was performed on the ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)with0.1% formic acid-water(A)and 0.1% formic acid-acetonitrile(B)in gradient elution as mobile phase.The flow rate was 0.5 mL·min-1.The column temperature was 40 ℃.MS instrument was equipped with ESI-ion source.Gaining The extracted ion chromatograms were obtained susquently.Results：There are differences in the composition and content from different habitats.Conclusion：The developed method for the simultaneous determination of the four phenylethanol glycosides is simple，accurate，and reproducible，has great theoretical significance for looking for high levels of phenylethanol glycosides of plant resources and habitats.

Lysionotuspauciflorus；phenylethanol glycosides；UPLC-MS/MS

国家自然科学基金项目(81373959)；中医药行业科研专项(201407003)；北京中医药大学自主选题资助项目(2016-JYB-XS125)

] 刘勇，教授，研究方向：药用植物亲缘学；Tel：(010)84738656，E-mail：yliu0126@aliyun.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.4.007

2016-07-06)

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