正交设计优化拟缺香茶菜总黄酮提取工艺△

陈慧平，李晓宁，罗含希，邹敏

(1.郑州大学医药科学研究院，河南 郑州 450052;2.云南中医学院，云南 昆明 650500)

·中药工业·

正交设计优化拟缺香茶菜总黄酮提取工艺△

陈慧平1*，李晓宁2，罗含希1，邹敏1

(1.郑州大学医药科学研究院，河南 郑州 450052;2.云南中医学院，云南 昆明 650500)

目的：优化拟缺香茶菜总黄酮提取工艺。方法：采用 L9(34)正交试验，以拟缺香茶菜总黄酮的含量为综合指标，采取加热回流方法，考察提取温度(A)、液料比(B)、提取时间(C)、乙醇浓度(D)4个因素对提取效果的影响。结果：最佳提取工艺为温度90 ℃、液料比40∶1、提取2.0 h、60%乙醇，平均得率为5.668 6%。结论：该工艺简便合理，稳定可行，可为拟缺香茶菜总黄酮提取工艺的确定提供依据。

拟缺香茶菜；总黄酮；正交试验；提取工艺

拟缺香茶菜别名野紫苏，为唇形科香茶菜属植物的干燥地上部分，治疗慢性咽炎及食管癌疗效确切[1]。在我国分布范围相当广泛，是民间广泛使用的草药，具有清热解毒、活血化瘀、抗菌消炎及抗肿瘤等功能[2]。根据系统预实验可知，拟缺香茶菜的化学成分主要含有二萜、三萜、黄酮等活性成分，其中黄酮含量比较高。黄酮类物质是一类在植物界中分布广泛、具有多种生物活性的多酚类化合物，具有抑菌、降压、保肝、美白、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、抗辐射等多种药理作用[3]。目前未见有关拟缺香茶菜总黄酮含量测定及提取工艺研究的报道。本实验采用回流热浸法进行正交试验设计，探究拟缺香茶菜总黄酮含量的最佳提取工艺，以期待为拟缺香茶菜的质量控制及其总黄酮的开发利用提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

lambda 35紫外可见分光光度计(perkin elmer)；AR1530型电子天平(梅特勒-托利多有限公司)；DFY-400摇摆式高速中药粉碎机(温岭市林大机械)。

1.2 试剂与药材

植物药拟缺香茶菜采自河南龙浴湾，经郑州大学药学院李继成教授鉴定为唇形科拟缺香茶菜。将采集的拟缺香茶菜地上部分自然阴干，磨碎，装入塑料袋密封，置于干燥阴凉处备用。芦丁对照品(批号：ld150822-17，Stanford analytical chemicals inc.)；硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠、乙醇均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 拟缺香茶菜总黄酮含量测定

2.1.1 供试品溶液的制备 精密称取拟缺香茶菜药材粉末2.000 g，加入一定的乙醇和水混合溶液于加热套中加热回流提取，过滤，滤渣再加一定量乙醇和水混合溶液回流，回流提取3次，合并滤液转至200 mL容量瓶中，加相应的水和乙醇至刻度定容，摇均，作为供试品溶液。

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取在120 ℃减压干燥至恒重的芦丁对照品0.012 26 g 置50 mL容量瓶中，加70%乙醇适量，水浴加热，完全溶解，放冷，加70%乙醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液(含无水芦丁0.245 2 mg·mL-1)。

2.1.3 测量波长的选择 吸取对照品溶液和供试品溶液各1.0 mL置25 mL的容量瓶中，先加5%亚硝酸钠溶液0.4 mL，摇匀，6 min后，加入10%的硝酸铝溶液0.4 mL，摇匀，6 min后，再加入4%氢氧化钠溶液4 mL，加水稀释至刻度，摇匀后，静置15 min，置紫外分光光度计lambda 35进行全波长扫描，得出在357 nm处有最大特征吸收峰，因此将357 nm定为最大吸收波长。

2.1.4 线性关系考察 精密吸取对照品溶液0.0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6 mL分别置于标号为0、1、2、3 、4、5的25 mL容量瓶中，按2.1.3项下操作。以试剂为空白参比液，将所有的待测溶液置紫外分光光度计lambda 35，在357 nm处测吸光度值，以芦丁浓度(X)作为横坐标，以吸光度值(Y)作为纵坐标，作图，回归处理后得标准曲线方程：Y=42.466X-0.138 02，相关系数r=0.999 5。结果表明，芦丁对照品在0.00～0.015 mg·mL-1与吸光度值呈良好线性关系。

2.1.5 精密度试验 取芦丁对照品6份，按2.1.3项下方法显色测定，结果RSD为0.16%，表明精密度良好。

2.1.6 稳定性试验 取适宜浓度的芦丁对照品溶液1.0 mL置25 mL容量瓶中，按2.1.3项下操作。以试剂为空白参比液，置紫外分光光度计lambda 35，在357 nm处测得吸光度值，以显色15 min后的时刻设为0时刻，在0、15、30、45、60、90、120 min测其吸光度，得出结果RSD为0.18%，说明芦丁的显色反应的稳定性良好，样品溶液应在显色后2 h内完成含量测定。

2.2 橘叶总黄酮提取工艺优化

根据预实验结果，影响拟缺香茶菜中总黄酮提取效率的因素主要有乙醇浓度、提取时间、液料比和提取温度，正交试验设计中每个因素选择3个水平值，因素水平值通过单因素考察来确定。

2.2.1 单因素考察

2.2.1.1 提取时间的考察 取样品粉末5份，每份2.000 g，精密称定，加入60%乙醇40 mL，温度为80 ℃，分别加热回流提取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，趁热过滤，共提取3次，合并3次滤液，用60%乙醇定容至200 mL，测定总黄酮含量，结果见图1。

图1 提取时间考察折线图

由图1可知，提取1.5 h能达到较好的效果，所以选取提取时间考察的水平值为1.0、1.5、2.0 h。

2.2.1.2 乙醇浓度的考察 取样品粉末5份，每份2.000 g，精密称定，分别加入40%、50%、60%、70%、80%乙醇40 mL，80 ℃加热提取1.5 h，趁热过滤，滤液另器保存，共提取3次，合并3次滤液，用对应浓度的乙醇定容至200 mL，测定总黄酮含量，结果见图2。

图2 乙醇浓度考察折线图

由图2可知，60%乙醇具有较好的提取效果，所以确定乙醇浓度考察的水平值为50%、60%和70%。

2.2.1.3 液料比考察 取样品粉末5份，每份2.000 g，精密称定，分别加入60%乙醇40、60、80、100、120 mL，80 ℃加热提取1.5 h，趁热过滤，滤液另器保存，提取3次，合并3次滤液，用对应浓度的乙醇定容至500 mL，测定总黄酮含量，结果见图3。

图3 液料比考察折线图

由图3可知，液料比40∶1具有较好的提取效果，所以确定液料比考察的水平值为30∶1、40∶1和50∶1。

2.2.1.4 提取温度考察 取样品粉末5份，每份2.000 g，精密称定，分别加入60%乙醇80 mL，加热提取1.5 h，分别在60、70、80、90、100 ℃下水浴加热提取，冷却至室温过滤，滤液另器保存，分别提取3次，合并3次滤液，用60%乙醇定容至250 mL，测定总黄酮含量，结果见图4。

图4 温度考察折线图

由图4可知，温度80 ℃具有较好的提取效果，所以确定提取温度考察的水平值为70、80、90 ℃。

2.2.2 正交试验 采用L9(34)正交试验表安排试验，并按2.1中方法，按各工艺提取条件对总黄酮量进行考察，具体因素水平和实验结果及对结果的方差分析，见表1～3。

因素及水平：考察温度(A)、提取时间(B)、液料比(C)、乙醇浓度(D)四个因素三水平进行正交试验，优选拟缺香茶菜黄酮的最佳提取工艺，以拟缺香茶菜总黄酮的含量为考察指标，选用L9(34)正交表进行试验，因素水平见表1。

由表2和表3可知，4个因素对总黄酮提取率的影响从大到小依次是：乙醇浓度>液料比>温度>提取时间。且由表3方差分析结果可知，乙醇浓度和液料比对提取率有显著性影响，提取时间和次数、温度对提取率没有显著性影响。由直观分析可知，总黄酮提取率最高的工艺应为A3B3C3D1，即用50%乙醇提取，液料比为50∶1，提取时间为2 h，提取温度90 ℃。

表1 因素水平表

表2 正交试验结果

注：A.提取温度；B.提取时间；C.液料比；D.乙醇浓度。

表3 方差分析结果

2.2.3 验证试验 精密称取拟缺香茶菜药材粗粉2.000 g，按最佳提取工艺条件A3B3C3D1平行操作，测定吸光度并计算黄酮含量，结果见表4。

表4 工艺验证试验 %

3 讨论

黄酮类化合物已被证明具有抗肝脏毒性、抗炎、抗菌、抗病毒、解痉、清除自由基、降血压、软化血管等生理活性。近年的研究发现，某些黄酮类化合物具有良好的体内外抗肿瘤活性，且对正常细胞毒性较小[4]。

根据“相似相溶”原则，黄酮类物质属于中等级性物质，易溶于中等或中等偏极性的溶剂中。乙醇水溶液由于引入了羟基，乙醇分子之间不但彼此以氢结合，而且和水分子也形成氢键，降低了水的极性，故黄酮类物质的溶解度增加。本工艺充分考虑到总黄酮和多糖溶解性的差异，在总黄酮提取过程中选择最适体积分数的乙醇作为溶剂，除了能最大限度地提取总黄酮外，还能尽量减少多糖的溶出，使测定结果更准确[5]。

总黄酮含量测定研究中，稳定性考察时随着时间的延长供试溶液的吸光度呈下降趋势，虽然在120 min内，数值变化RSD值仅为0.18%，较稳定，但最好能在显色后60 min内完成测定工作，以减小测量误差。

本实验优选的提取工艺稳定、合理、可行性较高，适用于拟缺香茶菜总黄酮的提取。综上所述，采用正交设计优化拟缺香茶菜总黄酮的提取工艺，能优选最佳工艺提取拟缺香茶菜中的总黄酮，为拟缺香茶菜的深入研究和开发利用提供实验依据，也有利于拟缺香茶菜药材的优劣鉴别，此外，本实验结果显示，拟缺香茶菜药材总黄酮含量较高，具有很好的开发潜力。

[1] 李火云，焦珂，张鹏，等.拟缺香茶菜化学成分研究[J].中草药，2014，45(2)：154-160.

[2] 陈慧平，马方，邹敏，等.拟缺香茶菜提取物体外对3种肿瘤细胞增殖的抑制作用[J].郑州大学学报(医学版)，2015，50(5)：624-626.

[3] 陈文龙，陈燕芬，卢传坚，等.土茯苓总黄酮提取工艺的正交设计优化[J].时珍国医国药，2014，25(3)：544-546.

[4] 张志东，林少珠，吴晓松.正交试验优化桑寄生黄酮的提取工艺[J].中药材，2012，35(5)：810-812.

[5] 付亮，袁璟亚，杨瑞武，等.正交试验优化淫羊藿总黄酮和多糖的分步提取工艺优化[J].食品科学，2012，33(24)：56-60.

OptimizationoftheExtractionTechnologyofTotalFlavonoidsfromIsodonexcisoidesbyOrthogonalExperiment

CHENHuiping1*，LIXiaoning2，LUOHanxi1，ZouMin1

(1.AcademyofMedicalandPharmaceuticalSciences，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052，China； 2.YunnanUniversityofTraditionalChineseMedicine，Kunming650500，China)

Objective：The optimal conditions of total flavonoids fromIsodonexcisoideswere investigated by orthogonal array design.Methods：The content of total flavonoids was determined spectrometrically using rutin as the reference substance.The effects of extraction temperature，extraction time，liquid/material ratio，ethanol concentration on the content of total flavonoids in extracts were investigated by one-factor-at-a-time method，and the extraction conditions were optimized by orthogonal array design.Results：Ethanol concentration and liquid/material ratio were the key factors that affected the extraction of total flavonoids.The optimal extractive conditions were obtained as follows：temperature 90 ℃，treatment time 120 min，liquid/material ratio 50∶1 and ethanol concentration 50%.Under these conditions，the extraction yield of total flavonoids fromI.excisoideswas 5.668 6%.Conclusion：The optimized process remarkably increases the extraction yield of total flavonoids fromI.excisoidesand has a promising prospect for practical applications.

Isodonexcisoides；total flavonoids；orthogonal array design；extraction

河南省自然科学基金(152300410159)；河南省高等学校重点科研项目(16A350011)

] 陈慧平，助理研究员，研究方向：天然药化及药理；Email：baihe7879@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.6.021

2016-10-12)

*[