人参各部位水解产物PPT PT及25-OH-PPD的含量测定

王丹，赵余庆

(1.沈阳市第二中医医院，辽宁 沈阳 110101；2.沈阳药科大学，辽宁 沈阳 110016)

·基础研究·

人参各部位水解产物PPT PT及25-OH-PPD的含量测定

王丹1*，赵余庆2

(1.沈阳市第二中医医院，辽宁 沈阳 110101；2.沈阳药科大学，辽宁 沈阳 110016)

目的：建立同时测定人参各部位总皂苷水解产物中人参皂苷元原人参三醇(PPT)、人参三醇(PT)、25-羟基原人参二醇(25-OH-PPD)含量的HPLC-ELSD检测方法。方法：采用Kromasil C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，柱温：25 ℃，流速：3 mL·min-1；流动相为甲醇-水，梯度洗脱，ELSD检测器，气化室温度：40 ℃，氮气压力：2.5×105Pa。结果：人参皂苷PPT、PT、25-OH-PPD分别在1.6～8 μg呈良好的线性关系，平均加样回收率分别为98.39%、97.97%、97.75%，RSD分别为0.94%(n=5)、1.10%(n=5)、1.27%(n=5)。结论：该方法简便、快速、重现性好，可用于人参皂苷水解产物的质量控制方法。

人参皂苷；水解；高效液相-蒸发光散射检测器；含量测定

人参是五加科人参属植物人参PanaxginsengC.A.Mey.的根，具有大补元气、复脉固脱、补脾益肺、生津止渴、安神等功效[1]。人参皂苷是人参各部位(根、茎叶、果实、花蕾)的主要有效成分，具有抗癌、抗休克、保护心肌等药理作用[2-4]。目前，测定人参皂苷的方法很多[5-7]，常用紫外检测器在203 nm检测，但因皂苷类成分在此波长下吸收较差，梯度洗脱时受试剂影响很大，基线漂移较大，更重要的是不能检测不含双键类的皂苷；而蒸发光散射检测器(ELSD)是一种通用型质量检测器，检测不受外部环境的干扰，试剂在检测器中蒸发，不干扰检测，是一种检测人参皂苷类成分的有效方法[8]。郑义等[9]采用HPLC-ELSD法测定三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的含量；赵岩等[10]采用反相HPLC-ELSD法测定西洋参和西洋红参中人参皂苷的含量。人参水解产物中原人参三醇(PPT)、人参三醇(PT)、25-羟基原人参二醇(25-OH-PPD)的含量测定未见报道，且PPT、PT、25-OH-PPD是抗肿瘤的有效成分[11-12]，本实验采用HPLC-ELSD法测定人参各部位水解产物中PPT、PT、25-OH-PPD的含量，该方法快速、简单，分离测定准确、可靠。

1 仪器和材料

1.1 仪器与试剂

PUMP K-501型高效液相色谱仪(龙尼柯仪器有限公司)；UV DETECTORK-2501紫外检测器(德国诺尔)；ELSD-UM 3000型(上海通微分析技术有限公司)；JS-3050色谱工作站(龙尼柯仪器有限公司)。人参皂苷元对照品PPT、PT、25-OH-PPD(实验室制备)；甲醇(HPLC级试剂)；实验用水为蒸馏水；盐酸；其他试剂均为分析纯。

1.2 材料

人参根、茎叶、果、花蕾总皂苷(辽宁省抚顺鑫泰人参保健品有限公司提供)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱 Kromasil C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)，进样体积：20 μL，柱温：25℃，流速：3 mL·min-1；流动相：甲醇(A)和水(B)按体积比83∶17混合，洗脱；ELSD气化室温度：40 ℃，氮气压力：2.5×105Pa。

2.2 对照品溶液的配制

精密称取对照品PPT、PT、25-OH-PPD适量，加甲醇制成质量浓度分别为0.80、0.80、0.80 mg·mL-1的对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取人参各部分(包括根、茎叶、果、花蕾)总皂苷水解产物样品适量，精密称定，加甲醇稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜(0.45 μm)滤过，制成质量浓度分别为10.00、10.00、10.10、10.10 mg·mL-1的供试品溶液。

2.4 标准曲线和线性范围

精密称取2.2项下的对照品溶液 2、4、6、8、10 μL，分别依次注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积，以进样量的自然对数值为横坐标(lgX)，峰面积的自然对数值为纵坐标(lgY)，得回归方程：PPT，lgY=4.001 17+1.715 14lgX(r=0.999 4)；PT，lgY=4.060 6+1.838 65lgX(r=0.999 1)；25-OH-PPD，lgY=3.877 33+1.376 67lgX(r=0.999 3)；线性范围：1.6～8 μg。对照品(A)与供试品人参根 (B)、人参茎叶(C)、人参果(D)、人参花蕾(E)色谱图见图1。

注：A.人参皂苷对照品；B.根；C.茎叶；D.果；E.花蕾。图1 对照品及人参各部位供试品色谱图

2.5 精密度试验

精密吸取2.2对照品PPT、PT、25-OH-PPD溶液10 μL，连续重复进样5次，照拟定的色谱条件进行测定。计算峰面积，RSD分别为 1.05%、1.55%、1.77%，结果表明精密度较好。

2.6 稳定性试验

取2.3项下的人参根供试品溶液，分别在0、2、4、6、8 h精密吸取20 μL，注入高效液相色谱仪，计算峰面积，结果人参皂苷PPT、PT、25-OH-PPD的RSD分别为1.84%(n=5)、2.18%(n=5)、2.31%(n=5)，说明供试品溶液在8 h内稳定。

2.7 重现性试验

按2.3项下处理供试品，平行制备5份人参根样品溶液，照拟定的色谱条件进行测定。计算峰面积，结果人参皂苷PPT、PT、25-OH-PPD的RSD分别为2.26%(n=5)、0.97%(n=5)、1.31%(n=5)。

2.8 加样回收率试验

精密称取人参根总皂苷水解产物29.00 mg(含人参皂苷元PPT、PT、25-OH-PPD分别为3.40%、4.40%、3.17%)，分别加1 mL质量浓度分别为0.95、1.20、0.90 mg·mL-1的人参皂苷元PPT、PT、25-OH-PPD对照品溶液，置5 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，每次进样20 μL，测定含量，重复5次，计算回收率，见表1。

表1 人参根总皂苷水解产物中PPT、PT、25-OH-PPD回收率试验测定结果

2.9 样品的测定

分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各20 μL，按上述色谱条件测定，外标法测定含量，结果见表2。

表2 人参各部位水解后样品的含量测定结果

3 讨论

人参作为一种抗肿瘤的药物，其抗癌活性成分一直被人们所关注。人参总皂苷水解转化为PPT、PT、25-OH-PPD等，而这些皂苷元恰恰是主要的抗肿瘤活性成分，其中25-OH-PPD的抗肿瘤活性大于人参皂苷Rg3[13]，所以利用分离到的化学成分作为对照品，进行定性与定量分析，为其品质评价提供科学依据。

利用HPLC-ELSD法测定人参各部位水解产物中皂苷的含量，具有快速、简单、分离测定准确、重现性好的特点；选定的流动相对PPT、PT、25-OH-PPD有良好的分离效果。该方法可用于PPT、PT、25-OH-PPD的含量测定。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2015：8-9.

[2] 冷雪，张立德，贾连群，等.人参皂苷Rb1对异丙肾上腺素诱导大鼠急性心肌缺血影响的作用机制[J].中国实验方剂学杂志，2015，21(24)：104-108.

[3] 黄京子，金香顺，董明新，等.人参皂苷Rg3在非小细胞肺癌放疗中增敏作用的实验研究[J].实用肿瘤学杂志，2010，24 (3)：264-267.

[4] 彭彬，陈茂山，蒲莹，等.人参皂苷Rg1延缓D-半乳糖大鼠脑衰老作用及机制的初步研究[J].重庆医科大学学报，2011，36(4)：419-422.

[5] 陈华丽，潘坚扬，瞿海斌，等.HPLC测定三七提取液中三七皂苷R2(S)、七叶胆苷XVII和人参皂苷F2的含量[J].中国现代应用药学，2015，32(9)：114-117.

[6] 毕晓黎，罗文汇，李素梅，等.超高速液相测定西洋参中人参皂苷Rg1、Re、Rb1的含量研究[J].中国药师，2012，15(5)：651-652.

[7] 张金秋，夏娟，孙光芝，等.RP-HPLC法测定人参花中11个人参皂苷含量[J].药物分析杂志，2015，35(9)：1596-1600.

[8] 蔡艳，郭文胜.HPLC-ELSD法测定西洋参中人参皂苷含量[J].陕西中医学院学报，2009，32(1)：64-65.

[9] 郑义，陈晓兰，丁宁，等.HPLC-ELSD法测定三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的含量[J].江苏农业科学，2013，41(5)：297-298.

[10]赵岩，刘金平，卢丹，等.反相高效液相色谱-蒸发光散射检测法测定西洋参和西洋红参中人参皂苷的含量[J].时珍国医国药，2006，17(10)：1956-1958.

[11]Wang W，Rayburn E R，Zhao Y Q，et al.Novel ginsenosides 25-OH-PPD and 25-OCH3-PPD as experimental therapy for pancreatic cancer：anticancer activity and mechanisms of action [J]．Cancer Lett，2009，278(2)：241-248．

[12]张有为，窦德强，陈英杰，等.人参皂苷对人体骨肉瘤细胞U2OS增殖的影响[J].中草药，2001，32(3)：232-236.

[13]Hao M，Wang W，Zhao Y，et al.Pharmacokinetics and tissue distribution of 25-hydroxyprotopanaxadiol，an anticancer compound isolated fromPanaxginseng，in athymic mice bearing xenografts of human pancreatic tumors[J].Eur J Drug Metab Pharmacokinet，2011，35(3-4)：109-113.

ContentDeterminationofGinsengVariousPartsHydrolysatesPPT，PTand25-OH-PPD

WANGDan1*，ZHAOYuqing2

(1.ShenyangSecondHospitalofChineseMedicine，Shenyang110101,China； 2.ShenyangPharmaceuticalUniversity，Shenyang110016,China)

Objective：To establish a quantitative method for simultaneous determination of PPT，PT and 25-OH-PPD by HPLC-ELSD in different parts of Ginseng hydrolysates.Methods：A Kromasil C18(150 mm×4.6mm，5 μm) was used to perform the determination，which was maintained at 25 ℃ throughout the analysis.Mobile phase was composed of methanol and water with flow rate at 3 mL·min-1under gradient elution.The evaporation light-scattering detector was used with its gasification chamber temperature at 40 ℃ and the nitrogen pressure 2.5×105Pa.Results：The linearity of PPT、PT、25-OH-PPD was good in 1.6 μg - 8 μg scope，average recovery rates were 98.39%，97.97%，97.75%，respectively，RSD were 0.94% (n=5)，1.10% (n=5)，1.27% (n=5)，respectively.Conclusion：This method is simple，fast，the reproducible.The method could be used for the quality control of Ginseng hydrolysates.

Ginsenoside；hydrolysis；HPLC-ELSD；content determination

] 王丹，主管中药师，研究方向：新药制剂，E-mail：3516588@qq.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.6.006

2016-11-03)

*[