清热养心颗粒对大鼠灌服环孢素药动学影响△

吴磊，戴国梁，王琼，陆超

(南京中医药大学 附属医院，江苏 南京 210029)

·基础研究·

清热养心颗粒对大鼠灌服环孢素药动学影响△

吴磊，戴国梁，王琼，陆超*

(南京中医药大学 附属医院，江苏 南京 210029)

目的：研究清热养心颗粒(QG)对环孢素(cyclosporine A，CsA)的药代动力学的影响。方法：超高效液相串联质谱测定大鼠全血中CsA浓度，实验动物分为对照组和实验组，对照组单独灌胃给予CsA，实验组灌胃给予清热养心颗粒及CsA。DAS 3.0药动学软件计算药动学参数。结果：CsA单独给药、CsA-清热养心颗粒联合给药，CsA在体内代谢动力学模型均为一室开放模型，联合给药后，CsA的t1/2显著延长，AUC显著增大。结论：清热养心颗粒可减慢CsA在体内的代谢过程。

清热养心颗粒；环孢素；大鼠；药代动力学；超高效液相串联质谱

环孢素(cyclosporine A，CsA)是一种临床常用的免疫抑制剂，适用于预防同种异体肾、肝、心、骨髓等器官或组织移植所发生的排斥反应。CsA的最小有效剂量到中毒剂量之间的剂量差值越窄，药物安全性越差。药物浓度过高会引起肾毒性、高血压等不良反应，但是不完全和不规则的口服吸收又会引起毒性的增加或免疫治疗失败[1-2]。大多数药物和食物会通过调控P-gp或CYP3A等方面来影响CsA的治疗全过程，一些钙离子通道拮抗剂抑制P-gp和CYP3A从而使病人口服CsA后体内血药浓度的血药浓度-时间曲线下面积和峰浓度有了显著的提高[3-5]。

清热养心颗粒(QG)的处方是由金银花、甘草、山豆根等多味药组成，是江苏省中医院专家总结了传统中医学家治疗病毒性心肌炎的经验方药后，临床多年尝试研制而成，具有清热解毒、养心安神功能。金银花自古被中医誉为清热解毒的良药，其酚酸类成分具有显著的抗炎、抗氧化、抗凝血等作用[6-7]。甘草性温，其活性成分甘草次酸有着一定的抗炎、抗病毒的功效[8]。百合主治劳嗽、咳血、虚烦惊悸等症，活性成分薯蓣皂苷元有效提高氧自由基清除能力，对血管内皮细胞功能进行改善[9]。苦参味苦，性寒，具有清热燥湿、祛风解毒的作用，其活性成分氧化苦参碱临床使用广泛，对心肌缺血和梗死有保护作用[10-11]。临床上，病毒性心肌炎患者在服用清热养心颗粒时常会与环孢素同用，发现疗效显著。

本实验对大鼠进行研究，临床使用中等效治疗量作为参照，对单剂量给予清热养心颗粒后大鼠体内CsA药动学参数的变化情况进行考察，以及清热养心颗粒在口服CsA的体内药动学过程是否产生影响进行研究，进一步判断清热养心颗粒是否为影响CsA的血药浓度的主要因素，为临床使用研究提供更多的理论依据。

1 材料

1.1 试药

清热养心颗粒(江苏省中医院制剂，10 g/袋，批号：20160501)；环孢素软胶囊(华北制药股份有限公司，25 mg/粒，批号：160110)；对照品CsA(浙江瑞邦药业有限公司，批号：10-140317，含量：99.3%)；环孢素D(上海同田生物技术股份有限公司，含量为95%，批号：13060821)。水为超纯水，甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器

Agilent G6430UHPLC-MS/MS液质联用仪(美国Agilent公司，所配超高效液相仪为Agilent 1290)；MassHunter数据处理系统(version B.05.00)；WH-2微型旋涡混合仪(上海沪西分析仪器厂)；AE240电子天平(上海梅特勒-托利多有限公司)；Millipore Drict-Q5纯水机(法国Millipore公司)；Labconco离心浓缩仪(美国Labconco公司)；Biofuge PrimoR冷冻高速离心机(德国Heraeus公司)。

1.3 动物

SD大鼠16只，雌雄各半，体重约250～270 g，由南通大学比较医学中心提供，合格证号：SCXK(苏)2014-0001。

2 方法

2.1 色谱及质谱检测条件

Phenomenex Gemini C18色谱柱(100 mm×2.0 mm，3 μm)；流动相：甲醇-2 mmol·L-1甲酸铵水溶液(75∶25)；流速：400 μL·min-1；柱温：60 ℃。离子源：ESI；离子化模式：正离子；定量模式：多反应监测模式(MRM)；毛细管电压：4000 V；干燥气温度：400 ℃；CsA的Fragmentor及CE值分别为100、15 V；内标环孢素D的Fragmentor及CE值分别为110、10 V；检测对象：CsAm/z220.2→m/z202.9；环孢素Dm/z234.3→m/z216.9。

2.2 对照品溶液的配制

取对照品CsA适量，精密称定，甲醇作为溶剂，将其稀释成0.05、0.25、0.5、2.5、5、10、50 μg·mL-1的系列对照品溶液。放冰箱保存(4 ℃)，备用。

2.3 内标物溶液的配制

取对照品环孢素D适量，精密称定，甲醇作为溶剂，将其稀释成1.1 μg·mL-1的内标物溶液，放冰箱保存(4 ℃)，备用。

2.4 全血样品处理

取全血100 μL，精密吸取，加入氟化钠10 mg，内标溶液10 μL(1.1 μg·mL-1)，涡旋30 s，加入乙醚1 mL，涡旋3 min，混合，4 000 r·min-1离心10 min后吸取上清液乙醚层，40 ℃氮气吹干，加入100 μL 75%的甲醇水溶液进行复溶，涡旋振荡2 min后，冷冻高速离心机(12 000 r·min-1)离心10 min，吸取上清液，5 μL分析进样。

2.5 药代动力学研究

大鼠16只(雌雄各半)，每组随机分得8只，并标记为实验组与对照组，在大鼠给药之前12 h禁食不禁水。实验组同时灌胃给予QG(100 mg·kg-1)、与CsA(10 mg·kg-1)；对照组只灌胃给予CsA(10 mg·kg-1)。2组大鼠分别于给药前及给药后0.083、0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、12、24、32、48 h从眼底静脉丛采血约0.2 mL。将全血样品于4 ℃保存。

2.6 数据处理

根据测得的血药浓度-时间，采用DAS 3.0处理与拟合，获得药动学参数。采用SPSS 15.0软件对实验组和对照组的药动学参数进行配对t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 专属性实验

在色谱检测下，CsA和环孢素D的保留时间约为1.85 min和1.71 min(见图1、2)。CsA和内标物环孢素D互不干扰，峰形较好，无杂峰干扰，基线平稳。

3.2 标准曲线制备

取空白全血100 μL，加入CsA系列标准溶液各10 μL，配制成相当于CsA全血质量浓度分别为0.005、0.025、0.05、0.25、0.5、1、5 μg·mL-1的全血样品。取5 μL分析，以峰面积与内标峰面积的比值Y对全血质量浓度X进行线性回归运算，求得CsA的回归方程：Y=0.456 2X-0.346 1(r=0.994 9)，定量下限是5 ng·mL-1。

注：A.空白全血样品；B.空白全血加入CsA (0.5 μg·mL-1)及环孢素D(1.1 μg·mL-1)；C.大鼠同时口服QG及CsA 6 h后全血样品；下同。图1 CsA的UHPLC-MS/MS离子流图

注：A.空白全血样品；B.空白全血加入CsA (0.5 μg·mL-1)及环孢素D(1.1 μg·mL-1)；C.大鼠同时口服QG及CsA 6 h后全血样品。图2 环孢素D(内标)的UHPLC-MS/MS离子流图

3.3 准确度和精密度

精密吸取空白全血100 μL，制备CsA 3个不同浓度(CsA全血质量浓度为0.01、0.5、4 μg·mL-1)的质控样品，每个浓度平行5份，连续3 d。根据随性标准曲线求得实测浓度。通过实测浓度计算出精密度和准确度。结果显示：CsA日内、日间准确度分别为96.2%～105.6%(RSD≤7.1%，n=5)和94.2%～107.3%(RSD≤7.9%，n=15)，结果经鉴定符合分析要求。

3.4 提取回收率

取空白全血100 μL，配制3.3项下低、中、高3个不同质量浓度含药全血质控样品，按2.4项下方法处理后分析，以全血中CsA的峰面积与相应质量浓度对照品溶液中CsA峰面积的比值计算出上述3种质量浓度的提取回收率，每个浓度平行做5份。经UHPLC-MS/MS测定后，由低到高3个质量浓度下CsA的提取回收率分别为：(71.4%±2.4%)、(72.3%±3.1%)和(71.7%±2.7%)。同时得到内标的提取回收率为(69.6%±2.8%)。

3.5 稳定性考察

取空白全血100 μL，配制3.3项下3个质量浓度含药全血质控样品，按上述样品的处理方法处理。分析物置溶液中24 h(室温)、将含药的全血样品置冰箱(-20 ℃)冻融3次、置冰箱(-40 ℃)长期冷冻28 d，对稳定性进行稳定性考察，样品平行3份。结果显示，24 h后(室温)环孢素质量浓度的RSD均小于8.3%，冰箱(-40 ℃)保存28 d质量浓度的RSD 均小于9.6%，环孢素经3个冻融期的质量浓度RSD均小于7.8%。

3.6 基质效应考察

取1.5 mL EP管若干，分别精密吸取质量浓度为0.1、5、40 μg·mL-1的CsA对照品溶液各10 μL，同时加入10 μL环孢素D溶液(内标)，再加入纯水补足至100 μL，涡旋震荡30 s，取5 μL溶液进UHPLC-MS/MS，测定分析物及内标峰面积并定义为A1。除不加环孢素D溶液(内标)外，另按2.4项下方法制备空白全血样品若干，氮气吹干后同上处理，测定分析物及内标峰面积并定义为A2。基质效应ME(%)等于两者之间的比值(A2/A1×100%)。3个不同浓度的CsA在全血样品中的基质效应分别为88.6%、92.3%、91.7%(n=3)，环孢素D(内标)基质效应为93.2%(n=9)。

3.7 大鼠体内药代动力学

表 1 对照组和实验组中大鼠体内环孢素的主要药动学参数

注：* P < 0.05。图3 对照组和实验组中大鼠体内环孢素 的平均血药浓度-时间曲线

4 讨论

目前，一般采用荧光偏振免疫分析法检测全血中CsA的浓度，但成本较高。本实验改用UHPLC-MS/MS法测定全血样品浓度，经过方法学确证后，符合生物样品分析方法的要求，并且该方法灵敏度高、分析时间短，可用于临床上大批样品的连续测定。

相关中药与CsA药物相互作用的研究已有报道，研究表明，人体同时服用盐酸小檗碱与CsA时，可促进CsA的吸收，从而提高CsA的生物利用度[12-13]。清热养心颗粒中黄连是全方的君药，而盐酸小檗碱是黄连主要活性成分，由此推测清热养心颗粒中的盐酸小檗碱促进了CsA的体内吸收，但确切的作用机制则有待进一步研究。

由于CsA治疗窗窄，毒性较大，体内CsA浓度的升高可能会引起严重不良反应。因此，临床上同时使用清热养心颗粒与CsA时，应密切监测CsA在血液中的浓度及人体相关生化指标，避免不良反应的发生。

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EffectofQingreyangxinGranuleonPharmacokineticsofIntragastricallyAdministeredCyclosporineAinRats

WULei，DAIGuoliang，WANGQiong，LUChao*

(AffiliatedHospitalofNanjingUniversityofTraditionalChineseMedicine，Nanjing210029，China)

Objective：To investigate the pharmacokinetic effect of Qingreyangxin granule (QG) on cyclosporine A (CsA) in rats.Methods：Concentration of cyclosporine A in rat whole blood was detected by UHPLC-MS/MS after rats were oral administration of QG or QG combined with CsA.Pharmacokinetic parameters were calculated by DAS 3.0 pharmacokinetic software.Results：Invivopharmacokinetic models of CsA.were one-compartment open models in both of the QG group and the QG combined with CsA group.After compatibility，CsA showed a significant longer int1/2，with significant increase in AUC.Conclusion：QG can reduce metabolic process of CsAinvivo.

Qingreyangxin granule；cyclosporine A；rat；pharmacokinetics；UHPLC-MS/MS

江苏省中医药管理局项目(JD201512)；江苏省药学会-奥赛康医院药学基金(A201607)

] 陆超，硕士，主管中药师，研究方向：中药临床药代动力学；E-mail：sinkly228@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.6.012

2016-10-18)

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