番茄红素对人肝癌HepG2细胞生长的影响及其机制△

赵孟雷

(邯郸市中心医院，河北 邯郸 056001)

·基础研究·

番茄红素对人肝癌HepG2细胞生长的影响及其机制△

赵孟雷*

(邯郸市中心医院，河北 邯郸 056001)

目的：研究番茄红素(Lycopene，LP)对人肝癌HepG2细胞生长的抑制作用及其机制。方法：体外培养并取对数生长期人肝癌HepG2细胞，分别给予不同质量浓度LP(5、10、20 μg·mL-1)和顺铂(40 μg·mL-1)进行干预，48 h后通过MTT比色法测定细胞增殖抑制率，通过流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡状况，采用Western blotting技术检测Bax、bcl-2、Cleaved Caspase-3蛋白表达。结果：经LP或顺铂干预48 h能够有效提高人肝癌HepG2细胞增殖抑制率，延长细胞周期G0/G1期并缩短G2/M期，提高细胞凋亡率(Apoptosis Index，AI)，上调Bax表达、下调bcl-2表达、提高Bax/bcl-2比值，上调Cleaved Caspase-3蛋白表达，LP上述作用均具有一定的剂量依赖性。结论：LP能够通过抑制细胞增殖并促进其凋亡而对人肝癌HepG2细胞生长具有一定的抑制作用，其机制可能与LP能够影响细胞周期进程并调节凋亡相关基因蛋白表达有关。

番茄红素；肝癌；HepG2细胞；生长；抑制

肝癌是发病率最高的恶性肿瘤之一，肝癌具有发病隐匿、发展迅速、转移及侵袭能力强、恶性度高的特点[1-2]，我国每年约11万人死于肝癌，居恶性肿瘤致死率第二位，急需研究能够有效控制肝癌进展和复发的新型药物和新的治疗方案。番茄红素(Lycopene，LP)是一种具有抗氧化、降低血糖、增强机体免疫力等多种生物学活性的胡萝卜素[3-6]，且近年来LP抗肿瘤作用也逐渐得到广大医药工作者的关注，既往研究发现番茄红素对肺癌、胃癌、前列腺癌、卵巢癌等均具有一定的抑制作用[7-10]，茄红素是否对肝癌具有治疗作用尚未见文献报道，本实验将通过体外培养人肝癌HepG2细胞并给予LP进行干预，探讨番茄红素对肝癌细胞生长的影响并探讨其作用机制。

1 材料

人肝癌HepG2细胞株(河北医科大学细胞生物研究室)；番茄红素(南京泽朗生物科技有限公司，纯度≥96%)；注射用顺铂(山东齐鲁制药有限公司)；DMEM 高糖培养基、胰蛋白酶、胎牛血清(Gibco公司)；MTT(Sigma公司)；Annexin V/PI细胞凋亡检测试剂盒(BD公司)；bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3单克隆抗体(碧云天生物技术有限公司)。

2 方法

2.1 细胞培养、分组与给药

人肝癌HepG2细胞株经复苏后植入DMEM高糖培养基进行培养并取对数生长期细胞进行下一步实验：0.25%胰酶消化、调整细胞浓度为5×104·mL-1后分为空白对照组、番茄红素组(5、10、20 μg·mL-1)和顺铂组(40 μg·mL-1)[11]，n=10；各组细胞继续培养24 h后分别给予相应浓度药物进行干预，48 h后进行各指标检测。

2.2 各组HepG2细胞增殖抑制率的测定

调整细胞浓度至5×104·mL-1，接种于96孔板，每孔滴加20 μL MTT溶液(5 mg·mL-1)，培养4 h后去上清液，加入DMSO 200 μL，振荡10 min后通过酶标仪测定波长570 nm处吸光度(A)值，计算各组HepG2细胞增殖抑制率：细胞增殖抑制率(%)=[1-(A实验组-A空白组)/(A对照组-A空白组)]×100%。

2.3 细胞周期的检测和细胞凋亡状况的观察

各组细胞经PBS洗涤，加入70%乙醇水5 mL，混匀并置4 ℃环境48 h培养后离心取细胞，经PBS洗涤并打散细胞团后加5μL水解酶Rnase(10 mg·mL-1)，置37 ℃环境1 h，加入碘化丙啶染液，避光孵育30 min，然后通过流式细胞仪进行检测，采用CELL Quest软件分析各组细胞的细胞周期时相及凋亡状况。

2.4 各组HepG2细胞bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表达的检测

各组细胞经PBS溶液洗涤后行超声裂解，低温离心(4 ℃，12 000 r·min-1，20 min)取沉淀，采用BCA法测定蛋白浓度，蛋白变性(沸水浴加热5 min)、上样(每孔上样30 μg)，经SDS-PAGE凝胶电泳后转PVDF膜、室温下5%脱脂奶粉封闭2 h，一抗(bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3，β-actin)4 ℃过夜，洗膜，二抗(1∶100)室温孵育1 h后经ECL系统显影；以β-actin为内参，以条带灰度值测定bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3表达相对量。

2.5 统计学方法

运用软件SPSS15.0进行统计分析，组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 LP对人肝癌HepG2细胞增殖抑制率的影响

MTT比色法检测结果见表1，经番茄红素或顺铂干预48 h能够显著提高人肝癌HepG2细胞增殖抑制率，且番茄红素对HepG2细胞的增殖抑制作用具有一定的剂量依赖性；番茄红素20 μg·mL-1组细胞增殖抑制率显著高于顺铂组。

表1 LP对人肝癌HepG2细胞增殖抑制率的影响

注：与空白对照组比较,*P<0.05，**P<0.01；与顺铂组比较,△P<0.05，△△P<0.01；下同。

3.2 LP对人肝癌HepG2细胞周期的影响

流式细胞术检测结果见表2，经番茄红素干预48 h能够显著延长人肝癌HepG2细胞周期G0/G1期、缩短S期和G2/M期，其中番茄红素20 μg·mL-1组较空白对照组和顺铂组均具有统计学差异；提示番茄红素能够阻滞细胞周期而起到抑制细胞增殖的作用。

表2 LP对人肝癌HepG2细胞周期的影响

3.3 LP对人肝癌HepG2细胞凋亡状况的影响

流式细胞术检测结果见图1，经番茄红素或顺铂干预48 h，能够诱导人肝癌HepG2细胞凋亡，数量明显增多，番茄红素诱导细胞凋亡的作用具有一定的剂量依赖性。各组细胞凋亡指数(AI)结果见表3，经番茄红素或顺铂干预48 h能够有效提高人肝癌HepG2细胞AI，且番茄红素20 μg·mL-1组人肝癌HepG2细胞AI显著高于顺铂组。

注：A.空白对照组；B.番茄红素5 μg·mL-1组；C.番茄红素10 μg·mL-1组；D.番茄红素20 μg·mL-1组；E.顺铂40 μg·mL-1组。图1 LP对人肝癌HepG2细胞凋亡状况的影响

组别AI(%) 空白对照组36±17番茄红素5μg·mL-1组195±48∗∗番茄红素10μg·mL-1组430±92∗∗番茄红素20μg·mL-1组676±101∗∗△△顺铂40μg·mL-1组369±68∗∗

3.4 LP对人肝癌HepG2细胞bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表达的影响

采用Western blotting法检测并通过灰度值进行半定量分析，结果见图3、表5，经番茄红素或顺铂干预48 h能够显著上调人肝癌HepG2细胞bcl-2、Cleaved Caspase-3蛋白表达，显著提高Bax/bcl-2比值；番茄红素该作用具有一定的剂量依赖性；其中番茄红素20 μg·mL-1组bcl-2 mRNA表达较顺铂组显著降低，Bax/bcl-2比值显著升高，Cleaved Caspase-3蛋白表达量显著升高。

注：A.空白对照组；B.番茄红素5 μg·mL-1组；C.番茄红素10 μg·mL-1组；D.番茄红素20 μg·mL-1组；E.顺铂40 μg·mL-1组。图3 LP对人肝癌HepG2细胞bcl-2、Bax、 Cleaved Caspase-3蛋白表达的影响

组别bcl⁃2/β⁃actinBax/β⁃actinBax/bcl⁃2CleavedCaspase⁃3/β⁃actin空白对照组059±017018±006031±012008±003番茄红素5μg·mL-1组046±013027±010058±017∗025±007∗∗番茄红素10μg·mL-1组042±009∗043±014∗∗102±039∗∗034±011∗∗番茄红素20μg·mL-1组027±008∗∗076±019∗∗281±085∗∗△△046±018∗∗△顺铂40μg·mL-1组034±011∗031±009∗∗091±040∗∗017±005∗

4 讨论

目前临床上对于肝癌的治疗主要采取手术切除结合术后放化疗的综合治疗方案[12]，但大多数患者就诊时已达病程中晚期、失去手术机会，目前临床上手术切除率仅为20%[13]，5年复发率高达60%以上[14]，严重危害着人类的生命健康，以抑制肿瘤细胞生长为切入点研究新型抗肿瘤药物成为提高临床疗效的新思路。

LP是一种具有广泛生物学活性的萘醌类化合物[3-10]，张玉江等[7]研究发现番茄红素能够抑制人肺癌H520细胞的侵袭和迁移而抑制肺癌细胞的扩散；范现英等[8]总结分析发现LP具有增强机体免疫力、诱导胃癌细胞凋亡的作用；张鑫等[9]研究发现LP能够抑制前列腺癌LnCaP细胞增殖；于海荣等[15]研究发现LP能够通过改变膜电位以及促进内源性活性氧的生成而抑制人宫颈癌Hela细胞增殖；鲁昊等[16]通过体外培养人喉癌Hep-2细胞并给予番茄红素进行干预研究发现，LP能够通过改变细胞周期而起到抑制Hep-2细胞增殖的作用。本研究发现经LP干预治疗48 h能够显著提高人肝癌HepG2细胞增殖抑制率，能够将人肝癌HepG2细胞阻滞于G0/G1期并提高细胞凋亡率，且LP 20 μg·mL-1剂量组细胞增殖抑制率和细胞凋亡率均显著高于顺铂组；提示LP能够通过抑制细胞增殖并促进其凋亡而对人肝癌HepG2细胞生长具有一定抑制作用。

细胞凋亡过程中Caspase和Bcl-2两大基因家族发挥着非常重要的调控作用，其中caspase-3是激活各种凋亡刺激因子(Apaf-1)的关键蛋白酶，参与细胞凋亡的启动及整个凋亡过程的调节；bcl-2能够抑制线粒体破裂，可直接与Apaf-1结合而抑制caspase-3激活，抑制促凋亡蛋白Bax细胞毒性作用，调节细胞内钙浓度，从而起到抑制细胞凋亡的作用[17]；Bax属于Bcl-2基因家族成员，具有诱导线粒体渗透性改变而释放细胞色素C、激活促凋亡蛋白caspase-9表现出促细胞凋亡作用[18]。此外，Bax能够与bcl-2聚合成二聚体，从而抑制bcl-2活性促进细胞凋亡，所以Bax/bcl-2比值更加能够体现Bcl-2基因家族对细胞凋亡的调控作用[19-20]。本研究发现，经LP干预能够有效上调人肝癌HepG2细胞Bax蛋白表达、下调bcl-2蛋白表达并提高Bax/bcl-2比值，上调caspase-3蛋白表达，这可能是LP诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的重要分子机制。

总之，LP能够通过抑制细胞增殖并促进其凋亡而对人肝癌HepG2细胞生长具有一定抑制作用，其机制可能与LP能够阻滞细胞周期并调节凋亡相关蛋白(caspase-3、Bax、bcl-2)表达有关。

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EffectsofLycopeneonGrowthofHumanHepG2Cell

ZHAOMenglei*

(HandanCentralHospital，Handan056001，China)

Objective：To investigate the effects of lycopene on the growth of human HepG2 cell.Methods：The human HepG2 cells in logarithmic growth phase was treated with lycopene (5，10，20 μg·mL-1) groups and cisplatin (40 μg·mL-1).The cellular growth inhibition rate was calculated by MTT，cell cycle and apoptosis rate were analyzed by flow cytometry，the expression of Bax，bcl-2 and cleaved caspase-3 protein was detected by western blotting.Results：The cellular growth inhibition rate of human HepG2 cell in lycopene treated groups and cisplatin treated group were significantly increased，the cell cycle was arrested at G0/G1phase，the apoptosis rate was significantly increased，the expression of Bax mRNA was significantly increased，while the expression of bcl-2 was significantly decreased，and the ratio of Bax/bcl-2 was significantly increased；the expression of Cleaved Caspase-3 protein was significantly increased；all of the effects of Lycopene above were dose-dependent with a certain.Conclusion：Lycopene has inhibitive effects on the growth of human HepG2 cells perhaps through inhibiting proliferation and inducing apoptosis；which perhaps related to its effects of altering the cell cycle and the expression of apoptosis-related genes and proteins.

Lycopene；hepatic carcinoma；HepG2 cell；growth；inhibitive effects

邯郸市科学技术研究与发展计划项目(1623208086ZC)

] 赵孟雷，主治医师，研究方向：普外科疾病研究；E-mail：hdzhml@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.6.008

2016-11-13)

*[