RP-HPLC法测定聚乙二醇重组人促红素成品中的甲硫氨酸的含量

安娜

哈尔滨乐泰药业有限公司 黑龙江哈尔滨 150025

RP-HPLC法测定聚乙二醇重组人促红素成品中的甲硫氨酸的含量

安娜

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目的：完善聚乙二醇重组人促红素成品中关于甲硫氨酸的含量的测定方法。方法：实验采用反向色谱法，色谱柱选取Waters Symmetry C18（4.6mm×250mm，5μm），流动相A为注射用水,流动相B为乙腈。检测波长为210nm，流速为1.0ml/min。结果：配制甲硫氨酸的浓度在11.25-33.36μg之间，验证在此范围内的线性，r=0.9993；验证规定浓度的甲硫氨酸的平均回收率，回收率为100.13%，RSD=0.2%。结论：经过方案验证，此方法简单，有效。方法的精密度、准确度及线性等符合中国药典的要求，此方法可用于检测聚乙二醇重组人促红素成品中甲硫氨酸含量的测定。

聚乙二醇重组人促红素；甲硫氨酸；反相高效液相色谱

聚乙二醇重组人促红素是用聚乙二醇（PEG）修饰重组人促红素(EPO)。聚乙二醇这种大分子量化合物本身对人体是无毒的[1]，在药品生产中常用来修饰蛋白质或多肽，从而对蛋白质或多肽产生保护作用，增加蛋白质或多肽药物的分子量，降低肾脏的排出速度，延长药物在体内的作用时间[2]。通过聚乙二醇的修饰还可以掩盖蛋白质或多肽的免疫原性，还可以封闭蛋白质或多肽药物的蛋白酶作用位点，使蛋白质或多肽药物不被蛋白酶降解[3]。聚乙二醇还能增加其修饰的蛋白质或多肽药物的水溶性。

由于聚乙二醇重组人促红素中的甲硫氨酸残基容易被氧化，为了减少这种氧化，在成品制剂中加入游离的甲硫氨酸[4]。为控制产品质量，成品制剂需要检测控制甲硫氨酸的含量，本文通过反相高效液相色谱法对甲硫氨酸和聚乙二醇重组人促红素进行分离，从而测定甲硫氨酸的含量。

1.仪器与试剂

1.1 仪器Waters e2695高效液相色谱仪，色谱柱选取Waters Symmetry C18（4.6mm×250mm，5μm）。

1.2 试剂 L-甲硫氨酸对照品（厂家：中检院；批号：140684-201102；规格100mg）。聚乙二醇重组人促红素成品（本单位）。乙腈（色谱纯，厂家：Dikma）。

2.方法与结果

2.1 色谱条件 流动相A：注射用水；流动相B：乙腈；检测器：紫外检测器；检测波长：210nm；流速：1.0mL/min；注温：30±5℃；进样量10μl；梯度洗脱。比例如表1.

表1 洗脱梯度

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 将L-甲硫氨酸对照品按照说明书要求减压干燥后，精密称取14.86mg置于10ml容量瓶中，用注射用水溶解并稀释至刻度，摇匀。

2.2.2 供试品溶液 聚乙二醇重组人促红素成品直接进样。

2.2.3 甲硫氨酸的阴性样品 不含有甲硫氨酸的聚乙二醇重组人促红素。

2.3 专属性 将对照品溶液、供试品溶液及甲硫氨酸的阴性样品分别注入液相色谱仪，并记录色谱图。在甲硫氨酸的阴性样品色谱图中，无甲硫氨酸峰，供试品溶液色谱图中，甲硫氨酸峰和聚乙二醇重组人促红素峰分离度大于1.5，两个峰的塔板数均大于5000.对照品溶液与供试品溶液色谱图中，甲硫氨酸峰的保留时间一致。

2.4 线性 精密称取处理后的甲硫氨酸对照品 148.3mg置于10ml容量瓶中，用注射用水溶解并稀释至刻度，摇匀。分别精密量取上述溶液0.5、0.8、1.0、1.2、1.5ml，分别置于10ml容量瓶中，用注射用水稀释至刻度，摇匀。分别注入液相色谱仪，记录色谱图。分别将甲硫氨酸的浓度和峰面积作为横、纵坐标，绘制标准曲线。甲硫氨酸浓度在11.25-33.36μg之间成线性，r=0.9993。

2.5 重复性 供试品溶液精密注入液相色谱仪，记录色谱图，连续六次进样，分别记录峰面积，甲硫氨酸峰面积的 RSD为0.47%，重复性符合要求。

2.6 回收率 精密量取已知甲硫氨酸含量的样品溶液适量，分别加入 70%、100%、130%的甲硫氨酸对照品。各个浓度分别注入高效液相色谱仪，每个浓度平行测定3次，分别记录色谱图。计算各个浓度的回收率，其中70%浓度的回收率为99.93%、100%浓度的回收率为100.12%、130%浓度的回收率为100.35%。

2.7 样品含量 将本公司生产的聚乙二醇重组人促红素成品连续 3批用本方法检测甲硫氨酸的含量，计算结果分别为100.92%、100.31%、101.22%。

3.讨论

甲硫氨酸是聚乙二醇重组人促红素成品制剂为保证样品稳定而加入的杂质，含量较小，常规的检测方法存在较大误差，不适用本品的检测。

本项实验显示，专属性实验中，甲硫氨酸峰和聚乙二醇重组人促红素峰分离度大于 1.5，两个峰的塔板数均大于 5000。本色谱条件可以达到有效分离的目的。线性实验中，甲硫氨酸浓度在11.25-33.36μg之间成线性，r=0.9993，线性关系良好。重复实验中，甲硫氨酸峰面积的RSD为0.47%，本方法的检测很稳定。回收率的实验中，回收率分别为99.93%、100.12%、100.35%，平均回收率为100.13%，RSD为0.2%。样品测试环节，结果准确，可靠。

通过本次研究表明，采用反相高效液相色谱法能够达到准确、快速、便于操作等检测甲硫氨酸含量的目的，可以作为聚乙二醇重组人促红素成品中的甲硫氨酸含量的检测方法。

[1] 杨凯睿, 高向东, 徐晨,等.聚乙二醇定点修饰蛋白质药物的技术和临床研究进展[J].现代生物医学进展, 2015,15(32):6381-6385.

[2] 谭旭坤, 余倩, 柯永乐,等.聚乙二醇修饰的原花青素脂质体的制备及稳定性研究[J].现代化工, 2016(7):64-67.

[3] 李德山, 姜兴昊, 徐鹏飞,等.不同维持剂量聚乙二醇修饰的FGF-21在Ⅰ型糖尿病小鼠中降糖作用的研究[J].东北农业大学学报, 2017, 48(2):69-75.

[4] 白宇, 王维, 东寰睿,等.重组人促红素异构体分析及其生物学活性检测[J].黑龙江科技信息, 2016(27):183-183.

R473.5

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1672-5018（2017）05-207-01