HPLC法测定盐酸左西替利嗪有关物质

董芮娟，杨立业

（浙江海洋大学食品与医药学院,浙江舟山 316022）

HPLC法测定盐酸左西替利嗪有关物质

董芮娟，杨立业

（浙江海洋大学食品与医药学院,浙江舟山 316022）

建立盐酸左西替利嗪中有关物质的HPLC测定方法。方法：采用Agilent SB-C18色谱柱（4.6 mm×25 cm，5 μm）对降解杂质和工艺杂质进行定量分析，以乙腈和0.7%磷酸溶液为流动相低压梯度洗脱，流速1.2 mL/min，检测波长为230 nm。结果：该色谱方法可检测到盐酸左西替利嗪的9种有关物质，主峰与各杂质峰间能达到良好分离；3批样品有关物质测定结果显示，总杂质含量低于0.4%。结论：方法学验证表明，本法可作为盐酸左西替利嗪有关物质质量控制的方法。

盐酸左西替利嗪；有关物质；高效液相法；分析

盐酸左西替利嗪（Levocetirizine Dihydrochloride）R-(-)2-[2-[4-[4-(氯苯基)苯甲基]-1-哌嗪基]乙氧基]乙酸二盐酸盐，分子式为C21H25ClN2O3·2HCl，相对分子质量为461.82。作为西替利嗪的R-对映体，也是西替利嗪的活性成份，其与组胺H1受体的亲和力比西替利嗪高2倍，比右西替利嗪约高30倍，选择性作用于H1受体，对M胆碱受体和5-HT受体作用较小[1]。1995年FDA批准UCB公司盐酸左西替利嗪片以商品名XYZAL上市。其消旋体为盐酸西替利嗪，1987年UCB公司以商品名Zyrtec将其推向市场。因消旋体中盐酸右西替利嗪（S-对映体）与受体有一定亲和性，会导致嗜睡等不良反应。

目前仅美国药典对盐酸左西替利嗪有关物质的检测方法中，将有关物质分为手性杂质和有机杂质两种，其中欧洲、英国对盐酸西替利嗪原料药的有关物质方法学基本采用的均为正相色谱系统，仅英国药典中盐酸西替利嗪制剂的有关物质方法学研究采用反相色谱系统。根据所收载的有关物质方法分别进行验证，结果发现采用方法学中要求的普通硅胶色谱柱进行研究，结果均不能达到基本的检测标准[2-7]。

结合欧洲药典（8.0）盐酸西替利嗪的有关物质，根据R1、R2、R3等取代基的不同，见图 1，将杂质分为A、B、C、D、E、F、G 等 7 种，美国药典将杂质种类分到11种[4]，本文参考英国药典对盐酸西替利嗪的质量标准，参考盐酸左西替利嗪的合成路线[8-11]，建立了盐酸左西替利嗪9种有关物质的质量标准，可将盐酸左西替利嗪的9个相关杂质进行分离，更适合中国目前在用的普通C18色谱柱。

图1 盐酸西替利嗪取代基结构示意图Fig.1 The structure diagram of Levocetirizine Dihydrochloride substituent

1 仪器与试剂

1.1 仪器

LC-2010C液相色谱仪，岛津公司；FA1104电子天平，上海天平仪器厂；ZF-2型三用紫外仪，上海市安亭电子仪器厂。

1.2 试剂

盐酸左西替利嗪原料（20150401，20150402，20150403）、乙腈（默克公司色谱级）、西替利嗪有关物质A(批号 130715)、B(130801)、C(130922)、D(130802)、E(131113)、F(130922)、G(130726)、4-CBH（2-GBL-169-1）分别由Molcan公司提供，纯度均为95%；左西替利嗪对照品批号100659-201102，纯度99.8%；对氯苯酚对照品，批号100498-200301纯度95%，均由中国食品药品检定研究院提供；磷酸、氢氧化钠、盐酸、双氧水为分析纯，纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

用十八烷基硅烷键合硅胶（Agilent SB-C18）色谱柱，0.7%磷酸溶液（10 mL磷酸溶液加水稀释至1 400 mL）为流动相A，乙腈为流动相B，进行低压梯度洗脱（见表1），检测波长230 nm，流速1.2 mL/min，柱温度30℃。

表1 梯度洗脱方式Tab.1 The mode of gradient elution

2.2 有关物质测定方法

取西替利嗪的杂质A、B、C、D、E、F、G、4-CBH、对氯苯酚和左西替利嗪等10种对照品适量，分别精密称定，加42%乙腈水溶液溶解稀释制成相应浓度，作为对照贮备溶液；精密量取西替利嗪有关物质C适量配制成每1 mL含5 μg，另分别精密量取上述各对照品适量配制成1 mL含0.5 μg，用42%乙腈水溶液定容混匀制成对照混合溶液；取左西替利嗪样品溶液适量，配制成每1 mL含左西替利嗪0.2 mg，作为供试溶液；精密量取上述供试品溶液1 mL，加流动相稀释至100 mL，再精密量取1 mL，加流动相稀释至10 mL，作为对照溶液；西替利嗪对照混合溶液确定各有关物质保留时间以左西替利嗪（60 min）为参照，分别约为：F=0.2、A=0.45、对氯苯酚=0.5、G=0.7、B=0.8、C=0.85、E=1.05、D=1.29、4-CBH=1.3。供试品溶液中若有杂质峰，其单个杂质不大于对照溶液主峰面积的2倍（0.2%）；非特异杂质：每个杂质不大于对照溶液主峰面积（0.10%）；总杂质不大于对照溶液主峰面积的4倍（0.4%）；可忽略杂质不大于对照溶液主峰面积的0.5倍（0.05%）。

2.3 专属性试验

取盐酸左西替利嗪对照品及西替利嗪杂质A、B、C、D、E、F、G、4-CBH、对氯苯酚各适量，精密称定，加稀释剂溶解并稀释制成混合对照溶液，进样分析，见图2。结果表明，在本文色谱条件下盐酸左西替利嗪与各杂质峰能达到良好分离，各色谱峰的分离度均大于1.5。

2.4 破坏试验

另取左西替利嗪原料药（20150401）适量，精密称定，用42%乙腈溶液溶解并稀释制成每1 mL含左西替利嗪200 mg，作为样品溶液，取1 mL溶液，分别进行不同条件下的降解试验，试验条件依次为（A）紫外光365 nm，253.7 nm 下分别光照 10 min、20 min、30 min、1 h、3 h、4 h；（B）60 ℃下分别放置 1 h、3 h、8 h、20 h；（C）加 1 mol/L盐酸溶液 100 μL，放置 1 h、3 h、6 h后，加入 1 mol/L氢氧化钠溶液100 μL中和；（D）加1 mol/L氢氧化钠溶液 100 uL，放置 1 h、3 h、6 h 后，加入 1 mol/L 盐酸溶液100 μL中和；（E）1%过氧化氢浓度的分别放置1 min，3%浓度放置 5 min，30 min；（F）将样品溶液敞口放置3 h；同时做空白溶剂试验。按2.1项下色谱条件测定上述溶液。各破坏试验的代表色谱图见图3。

总结破坏试验结果，当双氧水浓度1%放置3 min时，左西替利嗪溶液降解50%；双氧水浓度3%放置5 min、30 min后均降解70%；敞口放置3 h，左西替利嗪溶液较稳定，无有关物质产生。

盐酸左西替利嗪样品溶液经碱破坏1 h和3 h时，左西替利嗪降解2.5%～3%，2.5 min出现的未知杂质峰的量与其平衡；碱破坏6 h后降解6%，而2.5 min未知杂质峰也相应增加6%。原因可能是氢氧化钠与左西替利嗪中的羧基缓慢发生反应，而形成极性较大的盐，故在此液相条件下出峰较快。

盐酸左西替利嗪样品溶液经酸破坏1 h时，左西替利嗪降解1%；破坏3 h左西替利嗪降解为83.6 min的未知杂质，二者按面积归一法达到平衡；破坏6 h后，左西替利嗪杂质峰回归至1 h，而3 h时候出现的83.6 min未知杂质峰则基本无。原因可能是左西替利嗪稳定形似为盐酸盐，在过量盐酸作用下，可能继续与左西替利嗪下的羧基不稳定，而形成83.6 min的未知中间产物；当放置6 h后，83.6 min的杂峰在强酸作用下转化为稳定的左西替利嗪。

盐酸左西替利嗪样品溶液60℃放置20 h后未知杂质个数及含量无明显增加，左西替利嗪主峰无变化。

盐酸左西替利嗪样品溶液在紫外光照情况下，10 min降解了25%，30 min时左西替利嗪已降解50%，各有关物质主要表现为未知杂质均呈现不同程度的增加，其中已知杂质F、G增加；而紫外光照1 h时，左西替利嗪降解了75%，30 min的各有关物质的较有不同程度的降低，杂质B、C、4-CBH呈现增加形式；光照4 h时，左西替利嗪完全降解，30 min的各有关物质的较有不同程度的降低，杂质B、C、4-CBH呈现增加形式，在整个降解过程中，溶剂峰附近的未知杂质峰持续增加。

图2 专属性试验图谱Fig.2 The illustration of specificity experiment

图3 破坏试验代表图谱Fig.3 The representative illustration of destruction experiment

以上破坏性试验结果表明，盐酸左西替利嗪样品溶液对紫外光、氧化极不稳定，碱性条件下会慢慢降解，而酸性条件下则呈现不稳定状态，耐高温。

2.5 线性关系

分别精密称取西替利嗪杂质对照品A、B、C、D、E、F、G、4-CBH、对氯苯酚9个杂质和左西替利嗪对照品适量，用42%的乙腈水溶液溶解稀释制成对照贮备液；分别精密量取适量配制成2.0、5.0、10.0、15.0和20.0 μg/mL系列浓度的对照混合溶液，按2.1项下色谱条件进行测定，由溶液质量分数（C）对峰面积（A）做线性回归，所得方程见表2。结果表明各浓度线性关系良好。

表2 盐酸左西替利嗪各有关物质线性关系Tab.2 The linearity of each related substance of Levocetirizine Dihydrochloride

2.6 检测限和定量限

分别精密称取西替利嗪杂质对照品A、B、C、D、E、F、G、4-CBH、对氯苯酚9个杂质和左西替利嗪对照品适量，用42%乙腈水溶液溶解稀释制成一定浓度的混合溶液；精密量取混合溶液适量，用42%乙腈水溶液逐级稀释进样分析，按信噪比S/N=3计算检测限，S/N=10为定量限，结果见表3。

表3 各有关物质检测限与定量限Tab.3 The LOD and LOQ of each related substance

2.7 精密度试验

按2.3项下混合溶液，分别于分别置于冰箱冷藏室24 h，48 h，7 d，10 d，20 d；室温24 h，按2.1项下色谱条件进样分析，考察混合对照溶液的稳定性。结果表明，待测溶液在以上环境下存放溶液稳定，各有关物质和左西替利嗪峰面积RSD均小于1%。

2.8 回收率试验

分别精密称取西替利嗪杂质对照品A、B、C、D、E、F、G、4-CBH、对氯苯酚9个杂质和左西替利嗪对照品适量，用42%的乙腈水溶液溶解稀释制成对照贮备液；分别精密量取适量配制成8.0、10.0和12.0 μg/mL系列的对照混合溶液各3份，按2.1项下色谱条件进行分析，以工作曲线折算试剂测量值，进而计算各回收率。经计算各杂质回收率均在90%～110%之间，RSD小于5%，回收率良好。

2.9 重复性试验

按2.3项下方法配置每1 mL中含左西替利嗪和各杂质10 μg的混合溶液6份，按2.1项下色谱柱进行进样分析，以工作曲线计算，考察方法重复性。经计算，杂质C含量的RSD为3.3%，其他各杂质含量的RSD均小于1%。

2.10 有关物质样品测定

取盐酸左西替利嗪原料适量，依2.1色谱方法测定，结果表明，三批检验结果均符合要求。

3 讨论

3.1 耐用性考察

普通C18柱（Diamonsil C18柱，4.6 mm×25 cm，5 μm）、酸性介质C18柱（Agilent SB-C18）、流速（0.8、1.2 mL/min）、柱温（25℃、35℃），结果表明流动相的酸度越低，越有利于各杂质的分离；因盐酸左西替利嗪的各杂质极性相差较大，水相比例直接影响各杂质峰的出峰情况，故采用低压梯度洗脱。分别考察了上述条件下各组分分离效果较好，证明该方法耐用性较好。

3.2 小结

本文通过HPLC法测定盐酸左西替利嗪的有关物质，结果显示，此高效液相色谱法更适合于中国境内常用的C18色谱柱，且能将西替利嗪的多种杂质有效分离，可用以盐酸左西替利嗪的有关物质检测。

[1]周 伟,周正波,张 玲.左旋西替利嗪治疗作用的研究进展[J].国外医学:皮肤性病学分册,2003,29(6):333-335.

[2]欧洲药典委员会.欧洲药典[S].8.0.欧洲药品质量管理局,2013：1 831-1 833.

[3]美国药典[S].第39版.4 539-4 541

[4]美国药典[S].第40版.3 331-3 333

[5]英国药典[S].2016,盐酸西替利嗪

[6]英国药典[S].2016,盐酸西替利嗪片剂

[7]国家药典委员会.中华人民共和国药典:二部[M].2015年版.北京:中国医药科技出版社,2015.

[8]王立升,王天文,朱红元,等.左西替利嗪的合成[J].广西大学学报:自然科学版,2007,32(4):384-386.

[9]赵蒙蒙,余朋高,尤庆亮,等.左旋西替利嗪二盐酸盐的合成研究进展[J].化学与生物工程,2010,27(3):18-22.

[10]张万年.药物合成设计[M].上海:第二军医大学出版社,2010.

[11]王其远,邹志红.左旋盐酸西替利嗪的合成工艺改进[J].中国药物化学杂志,2008,18(4):273-275.

Determination the Related Substance in Levocetirizine Dihydrochloride by HPLC

DONG Rui-juan YANG Li-ye
（Food and Medicine School of Zhejiang Ocean University，Zhoushan 316022,China）

To establish a HPLC method of the concent and related substances of Levocetirizine Dihydrochloride.Methods：RP-HPLC was adopted to determine Levocetirizine Dihydrochloride related substances，quantitative analysis of degradation and process impurities using an Agilent SB-C18 column(4.6 mm×25 cm，5 μm)with a low pressure gradient elution system of acetonitrile-0.7%phosphoric acid，while the flow rate was 1.2mL/min and the detection wavelengh was 230 nm。The result shows the related substance in Levocetirizine Dihydrochloride can be detected by this chromatographic method ，related substances were completely separated from the main constituents；according to the result，the related substance of three bacthes were lower than 0.4%。The conclusion shows that this method is proved by the validation that it can be used for the related substance control of Levocetirizine Dihydrochloride。

Levocetirizine Dihydrochloride；related substance；HPLC；analysis

R917

A

1008－830X(2017)03－0223－05

2017-01-09

浙江省公益计划项目(2017C33126)

董芮娟（1981-），女，山西芮城人,工程师，硕士研究生,研究方向：海洋药物.

杨立业（1963-），男，副教授，E-mail:liyey@zjou.edu.cn