双重滤光紫外照射增加海蜓体内维生素D3的含量

张薇薇，刘炳禹，夏亚男，林欣欣，黄陈佩玉，关丽萍

（浙江海洋大学食品与医药学院，浙江舟山 316022）

双重滤光紫外照射增加海蜓体内维生素D3的含量

张薇薇，刘炳禹，夏亚男，林欣欣，黄陈佩玉，关丽萍

（浙江海洋大学食品与医药学院，浙江舟山 316022）

生物体内的7-脱氢胆固醇经紫外照射后会转化为维生素D3。在合成维生素D3的过程中有多种光异构化产物，光异构产物取决于激发的紫外波长，本实验加入两种滤光液窄化高压汞灯紫外波长在280～330 nm。利用不同波长与不同强度的紫外光对海蜓进行照射，以促使其体内的7-脱氢胆固醇转化为维生素D3。根据《中华人民共和国药典》，采用高效液相色谱法测定提取得到的维生素D3的含量，并进行对比以探究最佳照射条件。实验结果表明，海蜓体内维生素D3最佳转化率的条件为：照射时长为60 min，照射波长为302 nm。

维生素D3；紫外照射；海蜓；高效液相色谱法

维生素D是一种脂溶性维生素，其不仅可以提高机体对钙、磷的吸收与利用，也可促进骨骼生长，但人体不能自行合成，需通过日晒或食物摄入获得。世界范围内维生素D不足和缺乏的发生较常见，与其相关的疾病由以往传统的骨骼畸形、骨质疏松等与骨相关的单一系统疾病延伸至癌症、自身免疫性疾病、感染性疾病、心血管疾病等多系统疾病[1]。

维生素D3是维生素D中生物代谢率最高的一种活性形式，主要来源于动物体内合成，体内的7-脱氢胆固醇经阳光照射后，会变成维生素D3。维生素D3是调节人和动物机体钙磷代谢的脂溶性维生素，对人体和动物的生长及保持良好的健康状况具有惊人的重要性，尤其在促进动物生长和高产方面具有重大的经济意义。它是预防和治疗佝偻病的一种药物，同时也是食品添加剂和饲料添加剂中必不可少的成份。随着人口的日益老龄化和畜牧业的发展,社会对维生素D3的需求将会越来越大[2]。

自然界的维生素D3主要存在于某些动物性食物中。成人的建议每日维生素D摄入量是10～20 μg。然而，一般情况下传统饮食不足以满足建议摄入量，单从食物中不易获得机体所需要的维生素D，虽然一些营养膳食补充剂可以弥补这种不足，但其吸收率往往低于40%，日光照射皮肤是机体合成维生素D的一个重要途径[3]。机体表皮中的7-脱氢胆同醇经紫外线照射可生成前维生素D3，前维生素D3经光解作用生成维生素D3，此反应不需要酶的参加，亦不伴有蛋白质的合成，是一种纯光化学反应。在维生素D3的光化学合成中，紫外光波长对7-脱氢胆固醇的光照产物分布起着决定性的作用，目前工业上仍采用高压汞灯生产维生素D3，由于汞灯发射出紫外及许多可见波段光谱体，光照异构产物较多，预维生素D3产率一般只有51%左右[4]。在实际应用上，可以通过添加滤光片或滤光液来窄化高压汞灯的波长段[5]。常见的滤光材料有滤光片、滤光膜和滤光液等。使用这些滤光材料后，可以过滤掉光源中部分波长的光，得到所需波长范围的光源，这样有助于提高大型光电仪器的准确度和精度[6,7]。滤光液较滤光片以及滤光膜具有低成本、易操作等特点，所以本实验通过使用带有双重滤光液的紫外汞灯，将紫外波长控制在280～330 nm之间，来控制7-脱氢胆固醇的光异构反应向产生维生素D3的方向进行。

舟山渔场位于西太平洋沿岸的长江口南部，是东海渔场的重要组成部分，这里水质肥沃、饵料生物丰富、水文环境适宜，是各种水生生物繁殖、索饵、生长的良好区域，历史上曾经是我国渔业资源最丰富、生产力水平最高的渔场之一[8]。海蜓（幼鳀加工的咸干品）盛产于浙江宁波、舟山等地区。海蜒价廉易得，营养丰富，含脂量高达26%～30%，为一般鱼类的近10倍。舟山地区居民饮食以鱼类为主，但据调查显示舟山地区1～5岁儿童维生素D缺乏的情况仍然较为突出[9]，市场上大部分鱼肝油产品都有较高含量的维生素D，但其吸收率较低。虽然像海蜓这类多脂肪鱼类、鱼肝油是获得维生素D3比较好的食物来源，分析其情况可能是由于海蜓主要分布于深海区域，受到光照较少，其体内的7-脱氢胆固醇无法发生光化学反应而转化为维生素D3。本实验旨在通过控制不同波长紫外光照射使海蜓体内的7-脱氢胆同醇转化为维生素D3，以期延伸到增加各种鱼类食品、保健食品及其他鱼类制品中维生素D3的含量。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

海蜓（购于舟山市场，自然风干）；乙酸乙酯、抗坏血酸、无水乙醇、氢氧化钾、无水乙醚、钨酸钠、硫酸钴、浓硫酸等均为国药（沪试）分析纯试剂；甲醇、正己烷、乙腈、异丙醇等均为TEDIA色谱纯试剂；维生素D标准对照品（购自sigma产品）；滤光液α为Na2WO4溶液，滤光液β为CoSO4-5%H2SO4溶液。实验用水均为去离子水（液相色谱用水过0.22 μm微孔滤膜）。

安捷伦1200系列高效液相色谱仪（HPLC，美国安捷伦科技公司）；高纯氮气（舟山市亿洋气体有限公司）；YF-103中药粉碎机（瑞安市永历制药机械有限公司）；紫外线高压汞灯；HC-1016高速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；BSA323S-电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；HHS-电热恒温水浴锅（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；磨口玻璃仪器及其他玻璃仪器（上海申玻仪器公司）。

1.2 色谱条件

反相色谱：色谱柱：Dikma C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-乙腈-水（50:50:2）；流速：1.8 mL/min；柱温：25 ℃；进样量：500 μL；紫外-可见光检测器，检测波长 λ=254 nm。

正相色谱：色谱柱：依利特 Hypersil SiO2柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：正己烷-正戊醇（997:3）；流速：1.5 mL/min；柱温：25℃；进样量：100 L；紫外-可见光检测器，检测波长 λ=254 nm。

1.3 方法

1.3.1 实验原理

如图1所示，7-脱氢胆固醇在光照条件下脱氢生成前维生素D3，前维生素D3在一定条件下（如加热）异构转化为维生素D3[10]。

1.3.2 处理与提取

实验装置示意图见图2，将带有滤光液的汞灯部分置于暗箱顶端，将待照射海蜓置于暗箱底端，调整汞灯与样品之间的距离使得照射距离为5 cm，以维持一定的紫外光照强度。

取海蜓放入带有滤光液紫外汞灯的暗箱内进行紫外照射，分别设置不同照射时长与波长，每10 min将样品翻面一次，确保照射均匀。照射后取一定量的样品置于粉碎机中粉碎，加入乙酸乙酯（料液比1:5）提取24 h。

将上述提取液浓缩得到供试品。参照《中国药典（二部）》（2015年版）[11]，取2 g供试品于皂化瓶，加入0.2 g抗坏血酸，30 mL无水乙醇，50%4 mL的氢氧化钾溶液，80℃水浴回流40 min，冷却后用水冲洗冷凝管内壁，并将皂化液转移至分液漏斗中，用乙醚萃取3次，合并醚层并小心地用水洗至中性，加入少量滤纸条除去乙醚提取液中的水分，并用低温水浴和氮气流吹除乙醚，之后迅速精密加入3 mL甲醇，超声助溶后转入离心管，离心，取上清液作为供试品溶液A。

1.3.3 制备与检测

参照《中国药典》（2015年版）配制维生素D标准对照品溶液，按照上述反相色谱条件进样，记录色谱图。取供试品溶液A进样，准确收集含有维生素D及前维生素D混合物的全部流出液，用氮气流吹干，精密加入3 mL正己烷，超声助溶，离心，取上清液得供试品溶液B。

取维生素D标准对照品溶液按照上述正相色谱条件进样，记录色谱图。取供试品溶液B进样，记录色谱图。根据峰面积积分比较维生素D的含量。

图1 维生素D3的光转化原理Fig.1 The light conversion principle of vitamin D3

图2 实验装置示意图Fig.2 The schematic diagram of experimental device

2 结果与讨论

2.1 滤光液对紫外波长的影响

滤光液具有特征吸收光谱、化学组成对光不敏感等特点，光源的辐射经过滤光液吸收后，得到特定波长的窄谱带光。常用的滤光液有PbSO4溶液、Na2WO4溶液、CoSO4-H2SO4溶液、NiSO4溶液等。

上述实验装置的带有滤光液的汞灯模块示意图见图3，汞灯外夹石英层分别装有两种滤光液，滤光液α为Na2WO4溶液，滤光液β为CoSO4-5%H2SO4溶液，上端为滤光液冷凝装置。通过调整滤光液α和滤光液β的浓度，就可以控制波长范围。紫外汞灯发射的广谱光源经过两层滤光液的过滤，得到实验所需要的窄谱光源。当滤光液α为0.8M的Na2WO4溶液，滤光液β为1.0M的CoSO4-5%H2SO4溶液时，波长范围窄化至280 nm～330 nm。

2.2 紫外光照时长对维生素D3转化的影响

设置全波长（280 nm～330 nm）条件进行紫外照射，将海蜓分为5组，每组的照射时长分别设置为10、30、60、90 min，空白组不进行紫外照射。

图3 汞灯模块示意图Fig.3 The schematic diagram of mercury lamp module

如图4所示，随着照射时间的延长，维生素D3的转化率呈递增趋势，但当照射时长超过60 min时，维生素D3的转化率的增长不明显，并且紫外照射时间过长会对紫外设备要求较高，难以实现。

2.3 紫外照射增加维生素D3含量HPLC

图5是未经过紫外照射和经过60 min紫外照射海蜓HLPC色谱图，A图中未经过紫外照射，没有维生素D3含量峰，B图是经过60 min紫外照射后在17.712 min显示维生素D3含量峰，C图是标准品VD3经过60 min紫外照射后在17.692 min显示维生素D3含量峰。从HPLC中可以看出紫外照射海蜓与标准品维生素D3经过紫外照射后出峰时间很相似，说明经过紫外照射确实能增加海蜓D3含量。

图4 紫外光照时长对维生素D3转化的影响Fig.4 The effect of UV irradiation time on Vitamin D3conversion

图5 紫外光照增加维生素D3的高效液相色谱图Fig.5 HPLC of UV irradiation time on Vitamin D3conversion

2.4 紫外光照波长对维生素D3转化的影响

设置紫外照射时长为60 min，将海蜓分为3组，通过调整两种滤光液的浓度比例，将照射波长固定为280 nm、302 nm和330 nm。

如图6所示，紫外照射波长为302 nm时，维生素D3的转化率显著高于其他波长条件下维生素D3的转化率，且在提取与皂化过程中，波长280 nm与330 nm照射提取出的油状物量少于波长302 nm照射的提取物，可能是7-脱氢胆固醇转化为了其他光异构产物。

3 结论

双重滤光液的使用，可以将广谱的光源窄化为所需波长范围的光源，此方法改善了维生素D3光化学合成过程中，光异构体复杂繁多的情况，提高了维生素D3的转化率。

随着照射时间的延长，维生素D3的转化率呈递增趋势，但当照射时长为90 min时，维生素D3的转化率的增长不明显，紫外照射时间过长对紫外设备要求较高，工业上难以操作，成本也较高，故照射时长60 min为最佳照射时长。紫外照射波长为302 nm时，维生素D3的转化率显著高于其他波长条件下维生素D3的转化率，且在提取与皂化过程中，波长280 nm与330 nm照射提取出的油状物量少于波长302 nm照射的提取物，可能是7-脱氢胆固醇转化为了其他光异构产物。综上所述，紫外照射海蜓鱼体内维生素D3最佳转化率的条件为：照射时长为60 min，照射波长为302 nm，照射距离为5 cm。

此外，本研究通过控制不同波长紫外光照射使海蜓体内的7-脱氢胆同醇转化为维生素D3，以延伸到增加各种鱼类食品、保健食品及其他鱼类制品中增加维生素D3的含量提供实验理论依据。

图6 紫外光照波长对维生素D3转化的影响Fig.6 The effect of UV irradiation wavelength on Vitamin D3conversion

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Dual Filter UV Irradiation Increases the Content of Vitamin D3in Engraulis japonicus

ZHANG Wei-wei,LIU Bing-yu,XIA Ya-nan,et al
(Food and Medicine School of Zhejiang Ocean University,Zhoushan 316022,China)

Vitamin D3is obtained from organisms of 7-dehydrocholesterol by UV-LED exposure irradiation.While it has many light photoisomers during the synthesis of vitamin D3,and the light photoisomers lie on UV-LED wavelength.In this research,we add two kinds of light filter solution to narrow the UV wavelength to 280-330 nm.Engraulis japonicus are irradiated with different UV-LED exposure conditions to promote the transformation of 7-dehydrocholesterol into vitamin D3.According to the"Pharmacopoeia of the People's Republic of China",use HPLC method to determinate the content of obtained vitamin D3and compare to explore the best irradiation conditions.The results show that the optimum conversion conditions of vitamin D3in Engraulis japonicus are as follows:The irradiation time is 60 min while the irradiation wavelength is 302 nm.

Vitamin D3；Ultra violet light；Engraulis japonicus；HPLC

TS254.9

A

1008－830X(2017)03－0235－05

2017-03-13

舟山市科技计划项目（2015C41015）；浙江省公益性技术应用研究计划（2017C33131）

张薇薇（1996-），女，江西上饶人，研究方向：水产品加工.E-mail:1151845400@qq.com

关丽萍.E-mail:glp730@163.com