山楂叶超高效液相色谱指纹图谱及聚类分析研究*

杨明宇，李明臣，徐宝欣，高 婧，李艳荣，潘海峰△

（1.承德医学院中药研究所/河北省中药研究与开发重点实验室，河北承德 067000；2.河北省滦平县中医院）

山楂叶超高效液相色谱指纹图谱及聚类分析研究*

杨明宇1，李明臣2，徐宝欣1，高 婧1，李艳荣1，潘海峰1△

（1.承德医学院中药研究所/河北省中药研究与开发重点实验室，河北承德 067000；2.河北省滦平县中医院）

目的:采用超高效液相色谱法（UPLC）结合相似度计算和聚类分析建立山楂叶指纹图谱共有模式，为山楂叶的质量评价提供参考。方法：采用Waters CORTECS UPLC C18色谱柱（3.0mm×100mm，1.6μm），以乙腈-0.1%甲酸水为流动相，梯度洗脱，流速0.2ml/min，检测波长320nm，柱温30℃，进样量3μl。对14批山楂叶进行检测，运用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》建立山楂叶UPLC指纹图谱并进行相似度计算和聚类分析。结果：通过聚类分析将14批山楂叶分为Ⅰ、Ⅱ两类，选取第Ⅰ类样品建立山楂叶UPLC指纹图谱共有模式。结论：本研究建立的方法可为山楂叶的质量控制提供参考。

山楂叶；超高相液相色谱指纹图谱；聚类分析；共有模式

1 仪器与试药

Waters AcquityTM超高相液相色谱仪；HC-2062高速离心机；KQ-700型超声波清洗器；AG-245型十万分之一电子分析天平。

绿原酸（120416）、牡荆素葡萄糖苷（151103）、牡荆素鼠李糖苷（151024），上海融禾医药科技有限公司；牡荆素（111687-200602）、金丝桃苷（111521-200303），中国药品生物制品检定所。甲醇、乙腈，色谱纯；实验用水，哇哈哈纯净水；其它试剂为分析纯。

山楂叶，由承德民族师范学院董建新教授鉴定为蔷薇科植物山里红或山楂的干燥叶。药材来源：河北省S1，S2，S3，S4，S6，S7，S11，S12，S14；河南省S5；四川省S8；山东省S9；山西省S10；浙江省S13。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Waters CORTECS UPLC C18（3.0mm×100mm，1.6μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%甲酸水（B），梯度洗脱：T：0-4-7-14-16-25-28-30min，A：12%-12%-17%-17%-25%-40%-80%-80%；检测波长320nm，流速0.2ml/min，柱温30℃，进样量：3μl。

2.2 混合对照品溶液的制备 分别精密称取绿原酸、牡荆素葡萄糖、牡荆素鼠李糖、牡荆素、金丝桃苷对照品适量，用甲醇溶解，制成每1ml含绿原酸0.033mg、牡荆素葡萄糖苷0.097mg、牡荆素鼠李糖苷0.196mg、牡荆素0.020mg、金丝桃苷0.038mg的混合溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备 精密称定山楂叶药材粉末（过60目筛）0.5g，置具塞锥形瓶中，加入60%甲醇溶液25ml，称重，超声（700W，40kHz）提取30min，取出室温放置后再称重，用60%甲醇溶液补足损失的量，摇匀，提取液于12000r/min离心10min，0.20μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.4 指纹图谱的建立

2.4.1 精密度试验：取同一药材（S6）供试品溶液，连续进样5次，按2.1的色谱条件进样测定，结果各共有峰相对保留时间、相对峰面积RSD＜3%，说明该方法精密度良好。

2.4.2 重复性试验：取同一药材（S6）平行制备6份供试品溶液，分别按2.1的色谱条件进样测定，结果各共有峰相对保留时间、相对峰面积RSD＜3%，说明该方法重复性良好。

2.4.3 稳定性试验：取同一药材（S6）供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24h按2.1的色谱条件进样测定，结果各共有峰相对保留时间、相对峰面积RSD＜3%，说明供试品溶液在24h内稳定。

2.4.4 样品测定：制备14批山楂叶的供试品溶液，按2.1的色谱条件进样分析，记录色谱图。根据指纹图谱检测结果，选择峰面积较大、峰形较好的色谱峰为共有峰，共标定16个共有峰。经与混合对照品指纹图谱的保留时间和紫外吸收曲线比，确认了绿原酸、牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素、金丝桃苷。

2.4.5 聚类分析：本研究以16个共有峰峰面积为变量，应用SPSS 19.0统计软件，对14批山楂叶进行系统聚类分析，结果见图1：当类间距离在5-10时，14批山楂叶被分为两类，S14为第Ⅱ类，其余为第Ⅰ类；结合相似度评价结果，选取第Ⅰ类作为建立共有模式的样品。

图1 14批山楂叶聚类分析树状图

2.4.6 山楂叶指纹图谱共有模式的建立：通过相似度评价、聚类分析，从14批山楂叶样品中筛选出13批化学成分和成分含量相对稳定的样品，将13批样品色谱图的AIA文件导入国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》，建立山楂叶指纹图谱共有模式（图2），并进行相似度评价，相似度均＞0.870。提示，所建立的共有模式可为山楂叶的质量控制提供依据。

图2 13批山楂叶药材UPLC指纹图谱叠加图

3 讨论

山楂叶现有指纹图谱研究多采用常规的HPLC法，但该法分析时间较长[6-7]。为此，本研究采用UPLC法建立山楂叶的指纹图谱，在保证分离度的前提下，能明显缩短分析时间，同时具有较高的灵敏度，可为进一步研究山楂叶的UPLC-MS化学成分识别提供依据。

本研究建立的山楂叶UPLC指纹图谱共标定出16个共有峰，但14批山楂叶与对照图谱匹配的相似度相比差异较大。为建立更加可靠的指纹图谱，本研究采用聚类分析，从14批山楂叶样品中筛选出13批成分和含量稳定的样品，并建立了指纹图谱共有模式，可为山楂叶药材的质量控制提供较全面、直观、简便的评价，为全面控制山楂叶的质量提供基础。

[1]陈钟，卢树杰，张维库，等.HPLC测定山楂叶总黄酮中牡荆素鼠李糖苷含量[J].中成药，2009，31(10)：1615-1616.

[2]高婷，曹阳，贾凌云，等.HPLC法测定14个地区山楂中羽扇豆醇的含量[J].沈阳药科大学学报，2010，27(5)：373-376.

[3]杨明宇，潘伟东，潘海峰.山楂叶的化学成分研究[J].承德医学院学报，2015，32(6)：522-524.

[4]耿慧春，满莹，赵智勇.山楂叶化学成分和药理作用研究进展[J].中国现代医生，2009，47(26)：12-13.

[5]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京：中国医药科技出版社，2015.32.

[6]杜义龙，李艳荣，张晓峰，等.承德产山楂叶的HPLC指纹图谱研究[J].中国现代应用药学，2012，29(10)：906-910.

[7]刘荣华，余伯阳.山楂叶HPLC指纹图谱研究[J].中成药，2007, 29(1)：7-11.

[8]吴学文，熊艳，杜方麓.聚类分析在中药材分类学中的应用[J].中南药学，2003，1(4)：232-234.

ULTRA-HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY FINGERPRINT AND CLUSTERING ANALYSIS OF HAWTHORN LEAVES

YANG Ming-yu, LI Ming-chen, XU Bao-xin, et al
(Institute of Chinese Materia Medica/Hebei Key Laboratory of Research and Exploitation of Traditional Chinese Medicine, Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective:To establish hawthorn leaf fi ngerprint common patterns by using UPLC combined similarity calculation and clustering analysis, and provide reference for the quality evaluation of hawthorn leaves.Methods:The UPLC was used with the condition that the column was Waters CORTECS UPLC C18column (3.0mm ×100mm,1.6μm); the mobile phase was eluted with gradient by acetonitrilee-0.1% formic acid; the fl ow rate was 0.2ml/min; the detection wavelength was 320nm; the column temperature was 30℃; the sample volume was 3μl. The UPLC fi ngerprint of 14 batches of hawthorn leaves was established by evaluation system of traditional Chinese medicine chromatographic fi ngerprint similarity (2004A version), and the similarity calculation and cluster analysis were carried out.Results:The 14 batches of hawthorn leaves were divided into Ⅰ, Ⅱ group by cluster analysis; and the hawthorn leaf fi ngerprint common pattern was established based on Ⅰgroup.Conclusions:The method established in this study can provide reference for quality control of hawthorn leaves.

Hawthorn leaves; UPLC fi ngerprint; Cluster analysis; Common pattern

R917

A

1004-6879（2017）05-0363-03

2016-11-18）

* 河北省教育厅青年基金项目（QN2016127，QN2017006）△ 通讯作者

山楂叶为蔷薇科植物山里红Crataegus pinnatifida Bge. Var. Major N.E.Br.或山楂Crataegus pinnatifida Bge.的干燥叶，主要产于河北承德、辽宁、山东、山西等地[1-2]，主要含有黄酮、有机酸、黄烷类等成分[3]。山楂叶有活血化瘀、理气通脉、化浊降脂之功效，其药材和制剂在临床上有着广泛的应用[4-5]。目前，关于山楂叶质量控制的研究多集中在高相液相（HPLC）指纹图谱的建立[6-7]，该方法虽然具有准确、重复性好的特点，但存在灵敏度低、耗时较长、耗费溶剂较多等缺点。为建立一种快速、高效的质量控制方法，本研究采用超高效液相色谱法（UPLC）建立山楂叶指纹图谱，通过相似度评价结合聚类分析[8]，以及建立山楂叶UPLC指纹图谱的共有模式，以期为山楂叶的质量控制提供依据。