液-质联用法测定不同产地山楂叶中4种成分的含量*

柏 玥，程佳慧，戈福星，孔德成，潘海峰，李艳荣

（承德医学院中药研究所/河北省中药研究与开发重点实验室，河北承德 067000）

液-质联用法测定不同产地山楂叶中4种成分的含量*

柏 玥，程佳慧，戈福星，孔德成，潘海峰，李艳荣△

（承德医学院中药研究所/河北省中药研究与开发重点实验室，河北承德 067000）

山楂叶；液-质联用技术；含量测定

山楂叶为蔷薇科山楂属植物山里红Grataegus pinnatifida Bge.var.major N.E.Br.或山楂Grataegus pinnatifida Bge.的干燥叶，主要含有黄酮类和有机酸等成分，具有活血化瘀、理气通脉、化脂降浊之功效[1-2]。近年来，采用HPLC-UV测定山楂叶中一个或多个黄酮类成分时有报道[3-4]，所涉及到的定量指标只能针对牡荆素鼠李糖苷等紫外吸收较强、含量较高的成分，但测定表儿茶素这样紫外吸收较弱且含量较低的成分比较困难。由于MS具有高度的灵敏度，使用液质联用（LC-MS）技术较易测得一些微量成分和紫外吸收弱的化合物。为此，本研究采用HPLCMS结合MRM模式，对不同产地山楂叶中4种成分（包括紫外吸收弱的表儿茶素）进行了含量测定，以期为山楂叶的质量控制研究提供实验依据。

1 仪器与试药

Agilent 1200 Series高效液相色谱仪，6310型质谱仪，ESI离子源，十万分之一电子分析天平，KQ-700型超声波清洗器。

对照品：表儿茶素（批号：151107）、金丝桃苷（批号：120105）、牡荆素鼠李糖苷（批号：151024）、牡荆素葡萄糖苷（批号：151103），上海久知化学品商行。乙腈为色谱纯，其它试剂均为分析纯，水为娃哈哈纯净水。

山楂叶：河北（S1-S15）、山东（S16-S20）、湖北（S21）、辽宁（S22）、河南（S23-S24）、江苏（S25-S26）、四川（S27）、山西（S28-S30）、浙江（S31）、安徽（S32-S33）共33批，经承德民族师范学院进行了鉴定。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Poroshell 120 SB-C18（2.1mm100mm，2.7μm）；以0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）为流动相，梯度洗脱：0-10-25-35-40-41-50min，A：90%-82%-80%-80%-40%-10%-10%，B：10%-18%-20%-20%-60%-90%-90%；流速0.15ml/min，进样量1μl，检测波长320 nm，柱温30℃。质谱条件：大气压电喷雾离子源（ESI），负离子扫描，多反应监测（MRM）模式，参数见表1。N2压力20psi，干燥气流速12.0L/min，干燥气温度350℃。

表1 4种成分MRM模式参数

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备：准确称取各对照品，用甲醇制

得含表儿茶素、金丝桃苷、牡荆素鼠李糖苷和牡荆素葡萄糖苷浓度分别为0.023、0.020、0.142和0.074mg/ml的贮备液。

2.2.2 供试品溶液的制备：精密称定山楂叶粉末0.5g，置具塞三角瓶，精密加入25ml 60%甲醇溶液，称重，超声提取（700W，40kHz）30min，放置室温，称重并补足失重，提取液离心10min（12000r/min），过0.20μm滤膜，取续滤液，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察：精密吸取制备的贮备液，倍比稀释法制备系列对照品溶液，各进样1μl。表儿茶素、金丝桃苷、牡荆素鼠李糖苷和牡荆素葡萄糖苷的线性方程分别为：Y=5.60×104X-2.75×104，Y=1.48×105X+1.65×105，

Y=6.58×104X+8.01×105和Y=6.31×104X+4.63×104，相关系数r均大于0.999，说明4种成分的线性关系良好。

2.3.2 精密度试验：取含5.75☒g/ml表儿茶素、5.00☒g/ml金丝桃苷、35.5☒g/ml牡荆素鼠李糖苷、18.5☒g/ml牡荆

素葡萄糖苷的混合对照品溶液1μl，进样6次，测定各离子对峰面积。4种成分离子对峰面积的RSD值均低于3.0%，表明方法的精密度良好。

2.3.3 稳定性试验：取山楂叶（S8），制备供试品溶液，分别于0、4、8、12、24、48h进样测定。4种成分离子对峰面积的RSD值均低于2.5%，说明样品溶液在48h内稳定。

2.3.4 重复性试验：取山楂叶（S8）细粉6份，每份0.5g，按2.2.2的方法制备供试品溶液。测得4种成分含量的RSD值均低于2.3%，表明试验重复性良好。

2.3.5 回收率试验：取山楂叶（S8）6份，每份0.25g，精密加入4种对照品（加入量为相当于0.25g样品中所含有的量），得表儿茶素、金丝桃苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素葡萄糖苷的回收率分别为101.7%、99.4%，101.3%、103.8%。

2.3.6 样品测定：取33批山楂叶分别制备供试品溶液，按照2.1的条件进行测定，结果见表2：

表2 33批样品含量测定结果（mg/g，n=3）

3 讨论

本研究采用LC-MS法对10个产地33批山楂叶进行了4个成分的含量测定，其中以河北、山东两产地为主。河北产山楂叶4个成分含量范围为0.00-0.94mg/g、0.10-2.93mg/g、0.03-6.36mg/g、0.01-3.95mg/g，山东产山楂叶4个成分含量范围为0.00-0.85mg/g、0.29-2.23mg/g、0.16-3.81mg/g、0.03-0.84mg/g。33批样品中部分样品检测不到表儿茶素，其余3种成分为山楂叶的主要成分，各批样品均能检测到，但含量有较大差别，可能与各地域条件、品种有关。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].中国医药科技出版社,2015.

[2]王领弟,李艳荣,张晓峰,等.山楂叶指纹图谱研究[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(19):74-78.

[3]王肖,杜义龙,赵胜男,等.承德产山楂叶中总黄酮和5种黄酮类成分含量的动态分析[J] 中.国实验方剂学,2013,19(17): 171-175.

[4]崔凤侠,吴成国,李赛颖,等.山楂叶提取物的指纹图谱研究[J].华西药学杂志,2014,29(1):66-69.

R284

A

1004-6879（2017）05-0436-03

2017-04-07）

* 河北省高校重点学科建设项目资助

△ 通讯作者