糖尿病视网膜病变与MMP-7基因多态性的相关性

杨 洁，张铁民，董微丽，马英慧，贾淑君

（承德医学院附属医院眼科，河北承德 067000）

糖尿病视网膜病变与MMP-7基因多态性的相关性

杨 洁，张铁民，董微丽，马英慧，贾淑君

（承德医学院附属医院眼科，河北承德 067000）

目的:探讨基质金属蛋白酶-7（MMP-7）-181A/G基因多态性与2型糖尿病视网膜病变（DR）发病风险的关系。方法：400例糖尿病（DM）患者根据是否合并DR分为DM组（205例）和DR组（195例），选取同期健康体检者261例作为对照组。采用限制性片段长度多态性(RFLP)-聚合酶链反应(PCR)检测三组受试者MMP-7-181A/G基因多态性。结果：三组受试者A、G等位基因频率，A/A、A/G、G/G基因型频率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。并且，与A/G+A/A基因型相比，携带G/G基因型不会增加2型糖尿病DR的发病风险。结论：MMP-7-181A/G基因多态性与2型糖尿病视网膜病变的发病无关。

基质金属蛋白酶-7；基因多态性；糖尿病视网膜病变

糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是2型糖尿病常见的并发症之一，也是导致2型糖尿病患者视力丧失的最主要原因，严重影响了糖尿病患者的生活质量，但发病机制至今尚未完全阐明[1]。在我国，随着社会经济的发展和人民生活水平的提高，糖尿病的发病率已达3.2%，DR也相应地成为近十年来我国发病率急剧升高的主要疾患[2]。基质金属蛋白酶-7（matrix metalloproteinases，MMP-7）可降解细胞外基质和基底膜，参与调节细胞的生长、凋亡、血管生成等过程。有研究发现，MMP-7-181A/G基因多态性与多种疾病有关[3-4]。本研究采用病例-对照的方法，探讨了MMP-7-181A/G基因多态性与DR发病风险的相关性。

1 材料与方法

1.1 一般资料 2014年5月至2015年8月我院收治的2型糖尿病患者400例，均符合1999年WHO关于糖尿病的诊断标准[5]。其中单纯糖尿病组（DM组）205例，男104例、女101例，平均年龄（48.05±11.28）岁；糖尿病视网膜病变组（DR组）195例，男100例、女95例，平均年龄（49.26±10.95）岁。选择同期我院健康体检者261例为对照组（Control组），男132例、女129例，平均年龄（47.25±11.78）岁。本研究经承德医学院附属医院伦理委员会批准，所有受试者均告知研究目的并签署知情同意书。

所有受试者均为中国北方汉族人，均接受详细的眼科检查，包括：最佳矫正视力、眼压、裂隙灯显微镜、眼底镜、眼底照相等。如眼底照相可疑为DR的受试者，行眼底血管造影检查以确诊DR，DR的诊断标准参照文献[6]。记录所有受试者的性别、年龄、身高、体重、体重指数、收缩压、舒张压等指标。

三组受试者一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。见表1：

表1 三组受试者一般资料比较

1.2 实验方法

1.2.1 DNA的提取：收集全部受试者外周血标本4ml，EDTA抗凝，-80℃保存，蛋白酶K消化-饱和氯化钠盐析法提取基因组DNA[7]。

1.2.2 MMP-7基因分型：采用RFLP-PCR法对MMP-7基因A-181G多态位点进行基因分型。引物设计参考文献[3]，上游引物5'-TGGTACCATAATGTCCTGAATG-3'，下游引物：5'-TCGTTATTGGCAGGAAGCACACAATG AATT- 3'。PCR反应体系为20μl，包括灭菌去离子水10.4μl，10×PCR缓冲液2.4μl，PCR染料2.4μl，DNA模板2.0μl，Taq DNA聚合酶0.4μl，三磷酸脱氧核糖核酸（dNTPs）0.4μl和上下游引物各1.0μl。PCR反应条件：预变性94℃5min，变性94℃ 30s，退火温度55.5℃ 45s，延伸72℃ 30s，共35个循环，最后延伸7min。PCR扩增产物在限制性内切酶EcoRⅠ37℃消化过夜后，用2%琼脂糖凝胶电泳分析MMP-7基因型。MMP-7-181A/G的G/G基因型为120bp和30bp，A/A基因型为150bp，A/G基因型为150bp、120bp和30bp。

1.3 统计分析 采用SPSS 19.0软件进行数据处理。计数

资料用率表示，组间比较采用行×列表的卡方检验。不同基因型的相对风险度用优势比（odd ratio，OR）及95%可信区间（CI）表示。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 MMP-7基因型频率分布 符合Hardy-Weinberg定律，观测值和理论值比较差异无统计学意义（P＞0.05），说明能够达到遗传平衡，具有很好的群体代表性。见表2：

表2 MMP-7基因型频率的Hardy-Weinberg遗传平衡性检验

2.2 MMP-7启动子区-181A/G基因多态性与DR的关系 三组受试者A、G等位基因频率，A/A、A/G、G/G基因型频率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3：

表3 三组受试者MMP-7-181A/G 单核苷酸多态性的基因型及等位基因型频率[n(%)]

2.3 MMP-7-181A/G单核苷酸多态性与DR发病风险的关系Control组与DR组比较，经校正的OR=1.198(0.454-3.163)；DM组与DR组比较，经校正的OR=1.210(0.430-3.403)（表4）。与A/G+A/A基因型相比，携带G/G基因型不会增加2型糖尿病DR的发病风险。

表4 MMP-7-181A/G单核苷酸多态性与DR发病风险的关系

3 讨论

基质金属蛋白酶(MMPs)是高度保守的依赖于锌离子的蛋白水解酶家族，可由多种细胞分泌，能降解细胞外基质(extracellular matrix，ECM)中的多种成分，也可通过激活其它MMPs发挥作用。MMPs基因启动子区的单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphism，SNPs)可通过影响蛋白质的表达和基因转录，从而影响多种疾病的发生、发展及预后[8]。MMP-7是MMPs家族的重要成员，可降解Ⅳ型胶原、弹力素、明胶、纤粘连蛋白和层粘连蛋白等基底膜和ECM的重要成分，其过度表达与口腔鳞癌、肺癌、食管癌、胃癌、结直肠癌、宫颈癌等肿瘤的发生、发展密切相关[9-11]。

基因多态性是指在一个生物群体中，同时和经常存在两种或多种不连续的变异型或基因型或等位基因，也称遗传多态性。从本质上讲，多态性的产生在于基因水平上的变异，一般发生在基因序列中不编码蛋白的区域和没有重要调节功能的区域。SNPs即散在的单个碱基的不同，基因组中单核苷酸的缺失、插入与重复序列不属于SNP，更多的是单个碱基的置换。人类MMP-7基因位于染色体11q21-q22，包含6个外显子，总长度约9.6kb。通过对MMP-7基因启动子区扫描发现了多种SNPs，其中181A/G备受关注。MMP-7基因启动子区-181bp处A→G突变(-181A/G)可通过产生热惊厥转录因子(HSTF)的结合序列NGAAN而改变启动子的转录活性，使mRNA的转录水平发生改变，影响MMP-7蛋白的表达，与多种疾病的遗传易感性有关[12]。基因多态性与DR发病风险之间的关系比较复杂，受地域、种族，以及不同基因之间相互作用等因素的影响。本研究显示，MMP-7基因启动子区-181A/G的SNPs与DR的发病无关，提示MMP-7基因启动子区-181A/G可能不参与DR的发生。但本组病例数相对较少，有待增加病例数进一步研究证实。

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CORRELATIONS BETWEEN DIABETIC RETINOPATHY AND POLYMORPHISM OF MMP-7 GENE

YANG Jie, ZHANG Tie-min, DONG Wei-li, et al

(Department of Ophthalmology, the Affiliated Hospital of Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective:To investigate the risk of diabetic retinopathy (DR) and polymorphism of matrix metalloproteinase-7 (MMP-7) -181A/G gene.Methods:400 diabetes mellitus (DM) patients were divided into DM group (n=205) and DR group (n=195) according to whether combined DR; 261 cases of healthy controls were taken as control group. RFLP-PCR was used to detect the polymorphism of MMP-7-181A/G gene of subjects in 3 groups.Results:There was no statistical significance about A, G allele frequency, and A/A, A/G, G/G genotype frequency among 3 groups (P＞0.05). Moreover, compared with A/G+A/A genotype, carrying the G/G genotype didn’t increase the risk of DR.Conclusions:The MMP-7-181A/G gene polymorphism has no relations with retinopathy of type 2 diabetes mellitus.

Matrix metalloproteinases-7; Gene polymorphism; Diabetic retinopathy

R587.2

A

1004-6879（2017）05-0366-03

2016-11-09）