茵栀黄对结构性雄甾烷受体CAR介导CYP3A4的转录调节作用*

李宝群，毕红东△，郭娜娜，庞泽华

（1.承德医学院药理学教研室，河北承德 067000；2.承德医学院2011级中西医本科）

基础医学

茵栀黄对结构性雄甾烷受体CAR介导CYP3A4的转录调节作用*

李宝群1，毕红东1△，郭娜娜1，庞泽华2

（1.承德医学院药理学教研室，河北承德 067000；2.承德医学院2011级中西医本科）

目的:探讨茵栀黄对CYP3A4转录表达的影响及机制。方法：Chang Liver细胞中加入0.01、0.1和1μM茵栀黄分别作用24h、36h和48h，采用RT-PCR法和报告基因方法检测CYP3A4 mRNA的表达水平。结果：不同浓度茵栀黄分别处理Chang Liver细胞24h和36h可明显升高CYP3A4 mRNA的表达水平（P＜0.05）；转入CAR载体的Chang Liver细胞经不同浓度茵栀黄处理36h均可激活CYP3A4的转录表达。结论：茵栀黄可能通过CAR介导增加Chang Liver细胞CYP3A4的转录表达。

茵栀黄；结构性雄甾烷受体CAR；CYP3A4；报告基因；转录表达

药物代谢酶CYP3A4是细胞色素氧化酶CYP450超家族的成员，参与了50%以上临床常用药和胆红素的代谢[1]。近年来发现，核受体是调控CYP3A4表达的关键因子，并且有研究证实结构性雄甾烷受体(CAR，一种核受体)可诱导CYP3A4的转录[2]。茵桅黄具有清热解毒、利胆保肝等多种作用，临床用于治疗肝炎、黄疸等疾病[3]。研究发现，很多具有解毒保肝的中草药(TCMs)都可影响药物代谢酶的表达，但尚缺乏分子机制的研究[4]。本研究在前期发现茵栀黄可诱导代谢酶CYP2C19的基础上，以核受体为切入点，应用半定量分析方法和报告基因的方法在转录水平进一步探讨了茵栀黄对代谢酶CYP3A4表达的影响及可能机制，以期为指导TCMs的安全应用提供有益信息。

1 材料与方法

1.1 材料 Chang Liver细胞，由本教研室冻存；rTaq酶，日本TaKaRa公司；逆转录试剂盒/报告基因分析试剂盒，美国Promega公司；重组真核表达载体CAR、报告基因载体CYP3A4，中南大学临床实验室惠赠。茵栀黄（DMSO溶解），湖南省药检所。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与处理：Chang Liver细胞用DMEM+10%胎牛血清，37℃、5% CO2培养箱培养。同时设置DMSO为溶媒对照组；10μM/L的苯巴比妥-DMSO为阳性对照组；茵栀黄处理组分别加入终浓度为0.01μM、0.1μM和1μM的茵栀黄，分别孵育24h、36h、48h后收集细胞。采用RT-PCR法检测Chang Liver细胞CYP3A4 mRNA的表达情况：各组细胞提取总RNA后逆转为cDNA。CYP3A4正向引物序

列5’-CCCCCTGAAAATTTGGGCCAA-3’，反向引物序

列5’-TAATTTTGGGGCTCAAAGGCT-3’。 扩增条件：94℃ 2min，94℃ 30s，42℃ 30s，72℃ 30s；30个循环。扩增产物经3%琼脂糖凝胶电泳后，紫外成像仪成像，用Quantity One 4.6.2软件（Bio-Rad公司）进行定量分析，以目的条带灰度值与β-actin条带灰度值的比值作为CYP3A4 mRNA的相对表达水平。

1.2.2 细胞转染和报告基因检测：转染前24h，按5×104细胞/孔将细胞接种至96孔培养板，转染时将200ng CYP3A4-promoter-Luc，50ng hCAR或pcDNA3.1-myc/his B(-)空载体，以及作为内对照的海肾荧光素酶报告载体20ng pRLTK与0.5μl LipofectamineTM 2000阳离子脂质体混合孵育后加入至1个培养孔，转染4h后更换为DMEM+10% FBS培养基再培养20h进行茵栀黄给药实验。分别加入0.01μM、0.1μM和1μM的茵栀黄处理36h后裂解细胞，同设DMSO溶媒对照组和含有10μM/L的苯巴比妥-DMSO阳性对照

组，各组细胞用报告基因分析试剂盒测定荧光素酶活性值，重复3次。

2 结果

2.1 茵栀黄对Chang Liver细胞CYP3A4 mRNA表达的影响 不同浓度茵栀黄作用24h、36h，Chang Liver细胞CYP3A4 mRNA的表达明显升高：0.1μM、1μM茵栀黄作用24h，三个浓度的茵栀黄作用36h，Chang Liver细胞CYP3A4 mRNA的表达均明显高于溶媒对照组（P＜0.05）。不同浓度茵栀黄处理48h，Chang Liver细胞CYP3A4 mRNA的表达明显降低：茵栀黄三个浓度组Chang Liver细胞CYP3A4 mRNA的表达明显低于溶媒对照组（P＜0.05）；并且，随着茵栀黄浓度的升高，Chang Liver细胞CYP3A4 mRNA的表达逐渐降低（P＜0.05）。见表1、附图：

表1 不同浓度茵栀黄作用不同时间Chang Liver细胞CYP3A4 mRNA的表达（±s ）

表1 不同浓度茵栀黄作用不同时间Chang Liver细胞CYP3A4 mRNA的表达（±s ）

与DMSO溶媒对照组比较：1)P＜0.05；与茵栀黄0.01μM组比较：2)P＜0.05；与茵栀黄0.1μM组比较：3)P＜0.05

组别 24h 36h 48h DMSO溶媒对照组 0.11±0.01 0.17±0.03 0.17±0.02苯巴比妥阳性对照组 0.21±0.01 0.53±0.04 0.54±0.061)茵栀黄处理组0.01μM 0.13±0.02 0.48±0.071) 0.08±0.021)0.1μM 0.19±0.041)0.51±0.061) 0.05±0.011)2)1μM 0.22±0.061) 0.52±0.051) 0.02±0.021)2)3)

附图 Chang Liver细胞CYP3A4 mRNA的表达（1,4,7：DMSO溶媒对照组；2,5,8：苯巴比妥阳性对照组；3,6,9：0.01μM、0.1μM、1μM茵栀黄作用36h）

2.2 重组真核表达载体CAR对CYP3A4的转录激活作用 与转入CAR载体DMSO溶媒对照组比较，转入CAR载体茵栀黄各处理组Chang Liver细胞CYP3A4 mRNA的转录水平明显升高（P＜0.05）；并且，转入CAR载体茵栀黄各处理组Chang Liver细胞CYP3A4 mRNA的转录水平均明显高于转入空载体Chang Liver细胞（P＜0.05）。无论是否转入CAR载体，茵栀黄3个浓度组Chang Liver细胞CYP3A4 mRNA的转录水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）；并且， 茵栀黄3个浓度组Chang Liver细胞CYP3A4 mRNA的转录水平与苯巴比妥阳性对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2：

表2 转入CAR载体后不同浓度茵栀黄处理36h对Chang Liver细胞CYP3A4转录水平的影响（±s ）

表2 转入CAR载体后不同浓度茵栀黄处理36h对Chang Liver细胞CYP3A4转录水平的影响（±s ）

与DMSO溶媒对照组比较：1)P＜0.05

组别 转入不同载体空载体 CAR DMSO溶媒对照组 1.01±0.02 1.44±0.20苯巴比妥阳性对照组 2.94±0.301) 13.24±2.711)茵栀黄处理组0.01μM 2.46±0.211) 9.15±0.461)0.1μM 2.58±0.131) 12.14±1.291)1μM 2.79±0.191) 13.22±2.371)

3 讨论

黄疸主要是肝细胞对胆红素摄取与排泄障碍的结果，中医将未结合胆红素增高所引起的黄疸称为“阳黄”。茵桅黄为中药制剂，源于《伤寒论》茵陈篙汤加减，主要成分为茵陈、桅子和金银花，具有抗炎、解毒、抗肿瘤、退黄之功效，目前临床上广泛应用于急、慢性肝炎及重症肝胆疾病的治疗和新生儿病理性黄疸的防治，对于“阳黄”疗效肯定[5-6]。目前，临床上治疗黄疸的西药主要有糖皮质激素、苯巴比妥，新一代药物有优思弗（熊去氧胆酸）等[7]。但传统西药都各有副作用，疗效也不尽如人意，而新药又价格昂贵，病人的经济负担较重。

关于黄疸机制的研究，过去多集中在OATP2（阴离子转运蛋白2）等胆红素代谢的转运体[7]。但众多研究提示，在胆红素代谢过程中CYP450超家族中的成员之一的CYP3A4占有重要地位，CYP3A4可代谢药物和包括胆红素和胆汁酸在内的多种内、外源性物质，其活性能影响肝脏对胆红素的摄取和结合能力。构成性雄烷受体(CAR)和孕烷X受体(PXR)属于孤儿核受体家族成员，肝脏和肠道表达较多，是一种核转录调节因子，具有特异性DNA结合区和转录活性区[9]，被配体激活后可调控下游一系列靶基因的转录，如CYP2C9、CYP3A4等[8-9]。CAR基因敲除鼠，由于CYP3A4

表达量降低导致胆红素代谢障碍可产生胆汁淤积造成的肝脏损害[10-11]。因此推测，CYP450酶活性降低可能是黄疸发生发展的重要因素，对CYP450酶的诱导可能是中药利胆退黄的作用基础。

本研究发现，茵栀黄（不同浓度作用24h、36h）可上调Chang Liver细胞CYP3A4 mRNA的表达水平，且呈一定的剂量依赖性；不同浓度茵栀黄作用48h时Chang Liver细胞CYP3A4 mRNA的表达水平降低，可能与茵栀黄抗肿瘤、抑制细胞增殖的作用有关，但还需进一步研究来验证。另外，本研究通过共转染CAR表达载体和CYP3A4报告载体，利用报告基因技术发现，茵栀黄可通过活化核受体CAR增加CYP3A4的转录。因此提示，CYP3A4表达水平增加后导致胆红素的排出增加可能是茵栀黄治疗黄疸的分子机制之一。

综上所述，通过研究茵栀黄对CYP酶的作用可为开发和研制治疗黄疸的新药，以及提高和改善临床上现有治疗黄疸药物的疗效提供实验依据。

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TRANSCRIPTIONAL REGULATION OF YINZHIHUANG ON CYP3A4 MEDIATED BY STRUCTURAL

MALE STEROID RECEPTOR CAR
LI Bao-qun, BI Hong-dong, GUO Na-na, et al (Department of Pharmacology, Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective:To investigate the effects and mechanisms of Yinzhihuang on transcription of CYP3A4.Methods:The Chang Liver cells were cultured with 0.01μM, 0.1μM, 1μM Yinzhihuang respectively for 24h, 36h and 48h. The expression of CYP3A4 mRNA was detected by RT-PCR and dual-luciferase reporter assay.Results:The Chang Liver cells were cultured with Yinzhihuang of different concentration for 24h and 36h could obviously increase the expression of CYP3A4 mRNA (P＜0.05). The Chang Liver cells that transfected CAR vector were cultured with different concentrations of Yinzhihuang for 36h could activate transcription of CYP3A4.Conclusions:Yinzhihuang may increase the transcriptional expression of CYP3A4 in Chang Liver cells mediated by CAR.

Yinzhihuang; Structural male steroid receptor CAR; CYP3A4; Reporter gene; Transcriptional expression

R961

A

1004-6879（2017）05-0361-03

2016-10-25）

* 河北省教育厅青年基金项目（QN2016127，QN2017006）

△ 通讯作者