红小豆锈病菌夏孢子萌发条件研究

韩冬，张洪臣，柯希望，左豫虎

（1.黑龙江八一农垦大学农学院，大庆 163319；2.黑龙江省宝清县种子管理站）

红小豆锈病菌夏孢子萌发条件研究

韩冬1，张洪臣2，柯希望1，左豫虎1

（1.黑龙江八一农垦大学农学院，大庆 163319；2.黑龙江省宝清县种子管理站）

豇豆单胞锈菌是引起红小豆锈病的病原菌。为了明确红小豆锈病菌夏孢子的萌发条件，以红小豆锈病菌ZXL01菌株为材料，研究了培养方法、温度、光照、储存条件和储存时间对红小豆锈病菌夏孢子萌发的影响。结果表明，最适红小豆锈病菌夏孢子萌发的培养方法为水琼脂平板法，夏孢子在水琼脂上2 h即开始萌发，随着培养时间的延长，萌发率逐渐升高，6 h后萌发率趋于稳定，萌发率为75.0%。夏孢子在15～25℃均可萌发，最适萌发温度为20℃。光照可明显抑制夏孢子萌发。夏孢子在4℃条件下储存360 d后已基本丧失萌发能力，而夏孢子在-20℃条件下储存360 d时仍可保持萌发活力。

红小豆锈病；豇豆单胞锈菌；夏孢子；萌发条件

由豇豆单胞锈菌（Uromyces vignae）[1]引起的红小豆锈病是在红小豆生产中危害最为严重的病害之一，在红小豆全生育期均可发生，该病主要侵害叶片、茎、豆荚。病害发生严重时，可导致叶片干枯、脱落，籽粒干瘪，甚至引起绝收[2]。红小豆锈病曾在拉丁美洲、澳大利亚、中国和美国等国家和地区有过大的流行和危害，给红小豆生产带来严重损失。Lingdren等[3]研究表明，豆类锈病在田间发生时，严重度每升高1%，则因锈病导致的产量损失就相应提高19 kg·hm-2。锈菌的主要无性孢子形态为夏孢子，红小豆锈病菌夏孢子重复侵染是红小豆锈病大面积发生的主要原因。夏孢子的萌发是锈病菌入侵寄主的第一步。目前，对于锈病菌夏孢子萌发的研究较多，其中包括小麦条锈菌[4]、小麦叶锈菌[5]、向日葵锈病菌[6]、葡萄锈菌[7]等，但是关于红小豆锈病菌夏孢子萌发条件的研究至今仍未见报道。明确红小豆锈病菌夏孢子适宜的萌发条件，对田间防治红小豆锈病具有重要意义。传统锈病菌夏孢子萌发方法多采用水琼脂平板法、孢子悬滴法、水培法等[8]，但何种方法培养适宜红小豆锈病菌夏孢子的萌发目前尚不明确。

因此，研究综合比较了三种常用培养方法的优劣，为掌握适用于不同试验目的的夏孢子萌发方法提供参考。在此基础上，探索了影响红小豆锈病菌夏孢子萌发的环境因素，包括温度、光照、储存条件及储存时间，为进一步明确红小豆锈病的侵染循环及病害的防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌种及品种

供试红小豆锈病菌菌株由研究小组于2013年在黑龙江省大庆市林甸县花园乡采集，并分离保存的单夏孢子纯培养物，鉴定并命名为ZXL01[1]。红小豆品种“宝清红”由宝清县种子管理站提供。

将感病红小豆品种“宝清红”种植在直径15 cm的花盆内，置于25℃，光照16 h温室内培养，当真叶展开度达70%左右时，采取涂抹法接种夏孢子[1]，并于20℃黑暗保湿培养24 h，之后移与温室内继续培养，接种后14 d收集新鲜夏孢子备用。

1.2 试验方法

1.2.1 夏孢子萌发最适培养方法的筛选

试验选取水琼脂平板法、水培法、孢子悬滴法等三个方法进行夏孢子萌发试验。收集到的新鲜夏孢子用无菌水（添加0.05%吐温20）配置成孢子悬浮液，用血球计数板将孢子悬浮液浓度调整为1×105个·mL-1备用。

水琼脂平板法：将浓度为1.5%的水琼脂培养基融化，制成厚度约2 mm的平板，用无菌刀片切下面积约为1.0 cm×1.0 cm的水琼脂薄膜放于无菌载玻片上，将收集到的新鲜夏孢子均匀抖落在琼脂薄膜上，为了保持湿度，在培养皿中铺好已润湿滤纸，并放入两根玻璃弯管，将载玻片倒放在玻璃弯管上，盖上皿盖。

孢子悬滴法：用移液枪吸取少量已配置好的孢子悬浮液滴于凹玻片上，为了保持湿度，同样，将凹玻片倒放在玻璃弯管上，置于已铺好润湿滤纸的培养皿中，盖上皿盖。

水培法：将5 mL配置好的孢子悬浮液加入在9 cm培养皿中，盖上皿盖。

以上三种处理均用parafilm封口膜将培养皿封好，置于20℃恒温培养箱中黑暗培养，分别在2、4、6、9、12、24 h时，观察夏孢子萌发情况，统计夏孢子萌发率。

1.2.2 温度对夏孢子萌发的影响

采用水琼脂平板法将夏孢子分别置于5、10、15、20、25、30、35℃恒温培养箱中黑暗培养，6 h后观察夏孢子萌发情况，统计夏孢子萌发率。

1.2.3 光照对夏孢子萌发的影响

采用水琼脂平板法将夏孢子分别置于全黑暗、全光照、光暗交替（3 h L∶3 h D）的20℃恒温培养箱中培养，6 h后观察夏孢子萌发情况，统计夏孢子萌发率。

1.2.4 储存条件及储存时间对夏孢子萌发的影响

收集到的新鲜夏孢子用真空干燥器（干燥剂为变色硅胶）进行干燥，之后将干燥后的夏孢子放入10 mm×75 mm试管中，用parafilm封口膜将管口密封，并将密封好的试管分别储存在4℃、-20℃条件下。采用水琼脂平板法将4℃、-20℃条件下的分别储存5、10、20、40、60、90、120、180、360 d的夏孢子置于20℃恒温培养箱黑暗培养，6 h后观察夏孢子萌发情况，统计夏孢子萌发率。

1.3 结果统计与分析

当芽管长度达到夏孢子直径的一半时计为萌发[8]，采用Olympus BX60光学显微镜观察并记录夏孢子萌发情况，每个处理重复观察三次，每个重复观察不同视野下的200个夏孢子，计算萌发率（萌发率=已萌发孢子数/观察孢子数×100%）。采用SPSS v16.0软件对各个处理所得数据进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 夏孢子萌发最适培养方法的筛选

三种方法处理的红小豆锈病菌夏孢子在20℃培养条件下的萌发结果如图1所示。夏孢子在水琼脂上2 h后即可开始萌发，萌发率为20.3%，并且随着培养时间的增加，萌发率逐渐增大，在6 h时萌发率达75.0%，24 h时萌发率达77.3%，并且6、9、12和24 h萌发率差异不显著，说明夏孢子在水琼脂上6 h后即可大量萌发（图2A），并且在水琼脂上观察到的夏孢子萌发产生双芽管（图2B）。以悬滴法和水培法培养的夏孢子在2 h后虽然也可萌发，但是萌发率显著低于琼脂平板法，萌发率分别为12.0%和1.3%，同样，2种处理下的夏孢子在6 h时基本上也已全部萌发，萌发率分别为32.0%和52.7%，显著低于琼脂平板法，悬滴法培养的夏孢子萌发率最低（图2C），水培法培养的夏孢子萌发时，随着芽管的伸长，孢子内部逐渐变透明，孢子颜色逐渐变浅（图2D）。鉴于红小豆锈病菌夏孢子在水琼脂上萌发率最高，6 h后萌发率趋于稳定。因此，后续试验均采用水琼脂平板、培养6 h的方法评价不同因素对夏孢子萌发的影响。

图1 不同培养方法的红小豆锈病菌夏孢子萌发率Fig.1Germination rate of different culture methods on the germination of urediniospores of Uromyces vignae

图2 不同方法培养6 h时红小豆锈病菌夏孢子萌发形态Fig.2Forms of germinated urediniospores of Uromyces vignae on different methods at culture 6 hours

2.2 温度对夏孢子萌发的影响

如图3所示，在不同温度条件下，红小豆锈病菌夏孢子萌发率存在显著差异。夏孢子在5℃和35℃时未见萌发，其余处理下均可萌发，其中适宜萌发温度为15～25℃，最适萌发温度为20℃，培养6 h时萌发率达73.7%。随着培养温度的升高，夏孢子萌发率逐渐降低，温度达到30℃时，夏孢子的萌发率仅为3.3%。

2.3 光照条件对夏孢子萌发的影响

光照条件对红小豆锈病菌夏孢子萌发影响较大（图4），夏孢子在全黑暗条件下培养6 h后萌发率高达71.7%，而在全光照条件下的萌发率为5.0%，3 h光照和3 h黑暗交替条件下的萌发率为13.3%。表明光照可以抑制夏孢子萌发，黑暗条件下有利于夏孢子萌发。

图3 不同温度培养6 h时红小豆锈病菌夏孢子萌发率Fig.3Germination rate of urediniospores of Uromyces vignae on different temperature at culture 6 hours

图4 不同光照条件培养6 h时红小豆锈病菌夏孢子萌发率Fig.4Germination rate of urediniospores of Uromyces vignae on different light conditions at culture 6 hours

2.4 储存条件及时间对夏孢子萌发的影响

结果表明，夏孢子在4℃和-20℃条件下，随着储存时间的延长，夏孢子萌发率逐渐降低（表1）。夏孢子在4℃条件下储存360 d时，培养6 h时的萌发率为1.3%，基本已丧失萌发活力，而-20℃条件下储存360 d的夏孢子在培养6 h时萌发率为12.3%，明显高于4℃条件（表1），表明夏孢子可在-20℃条件下可保存360 d而不丧失萌发活力。

表1 储存条件和时间对豇豆单胞锈菌夏孢子萌发的影响Table 1Effects of storage conditions and time on the germination of urediniospores of Uromyces vignae

3 结论与讨论

通过对三种夏孢子萌发方法作了综合比较，可知红小豆锈病菌夏孢子在水琼脂上培养时萌发效果最好，培养2 h后即可萌发，6 h后夏孢子大量萌发，萌发率达到75.0%。而且研究还发现夏孢子在水琼脂上萌发可产生双芽管，该结果与向日葵锈病菌夏孢子萌发现象一致[6]。但是采用水琼脂平板法培养夏孢子时，夏孢子产生的芽管易深入琼脂内，导致萌发的孢子及芽管不利于收集，如果需要以芽管为材料进行分子生物学研究，可采用水培法进行夏孢子萌发实验，水培法培养夏孢子时可收集大量纯净的芽管。

温度是影响真菌孢子萌发最重要的因素[8]，红小豆锈病菌夏孢子萌发适宜温度为15～25℃，最适温度为20℃，与小麦叶锈菌[5]和落叶松-杨栅锈菌[9]夏孢子最适萌发温度的研究结果一致。有研究表明，连续光照对小麦杆锈菌夏孢子萌发的影响不大[10]，但研究结果表明红小豆锈病菌夏孢子在全光照条件下培养6 h后萌发率仅为5.0%，而在全黑暗条件下萌发率可达71.7%。红小豆锈病菌夏孢子在4℃和-20℃条件下随着储存时间的增长，孢子萌发率逐渐降低，这与胡文婕等[6]关于向日葵锈菌夏孢子萌发条件的研究结论一致。使用新鲜的孢子进行生物测定可以确保较高的萌发率[11]，而研究发现夏孢子在-20℃条件下储存360 d后，萌发率还可达到12.3%。因此，红小豆锈病菌夏孢子应选择在较低温度条件下储存，低温条件可使红小豆锈病菌夏孢子在储存360 d时还可保持萌发活力。

研究对传统的夏孢子萌发方法作了综合比较，掌握了适用于不同研究目的的夏孢子萌发方法，并明确了红小豆锈病菌夏孢子萌发的基本条件，为进一步研究红小豆锈病菌的侵染循环及病害可持续控制奠定基础。

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Study on Germination Conditions of the Urediospores of Uromyces vignae

Han Dong1，Zhang Hongchen2，Ke Xiwang1，Zuo Yuhu1
（1.College of Agronomy，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319;2.Seed Management Station of Baoqing County）

Uromyces vignaewas the pathogen which caused adzuki bean rust.In order to clarify the urediospores germination conditions ofUromyces vignae，urediospores of theUromyces vignaefungus ZXL01 were used to determine the effects on the germination of culture methods，temperature，light，storage conditions and storage time.Results showed that the optimum method was cultured on agar plate，and the urediospores germinate initially within 2 hours.The germination rate was gradually increased and stabilized around of 75.0%until 6 hours after inoculation.The suitable temperature for urediospores germination ranged from 15℃to 25℃，and the optimal temperature was around 20℃.Light had inhibitive effect on urediospores germination.It was ascertained that the urediniospores had lost their germination abilities after stored for 360 days at 4℃，but could still germinate at-20℃.

adzuki bean rust;Uromyces vignae;urediospores;germination conditions

S435.21

A

1002-2090（2017）04-0011-05

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.04.003

2016-12-17

国家科技支撑计划项目子项目（2104BAD07B05-06）；黑龙江省科技厅项（2014BAD07B05-H08）；学成、引进人才科研启动计划（XYB2014-14、XYB2014-09）。

韩冬（1991-），男，黑龙江八一农垦大学农学院2014级硕士研究生。

左豫虎，男，教授，博士研究生导师，E-mail：zuoyuhu@byau.edu.cn。