牛冠状病毒HE基因的克隆及进化树分析

魏姗，谷城，李春秋，边秀东，孙筱镟，郜洪泉，邢宇昕，张鹏宇，张立春，孙东波

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319）

牛冠状病毒HE基因的克隆及进化树分析

魏姗，谷城，李春秋，边秀东，孙筱镟，郜洪泉，邢宇昕，张鹏宇，张立春，孙东波

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319）

为研究牛冠状病毒（Bovine Coronavirus，BCV）HE基因进化关系，试验利用提取牛冠状病毒核酸，将RNA反转录成cDNA，并以此为模板扩增出全长为1 300 bp HE基因片段，将其与pMD-18T载体连接，产物克隆入DH5α感受态细胞，测序，结果与GenBank中已发表的14株BCV的HE基因序列进行系统进化树分析。扩增出的牛冠状病毒HE基因序列（HLJ-14），符合HE基因型参照序列特点，与GenBank中已发表的另外14株BCV HE基因型全序列同源性为97.3%～98.8%。

牛冠状病毒；HE基因；克隆；进化树

牛冠状病毒属于尼多病毒目（Nidovirales），冠状病毒科（Coronaviridae）冠状病毒属（Coronavirus）[1-2]，又称日冕病毒[3]。该病毒为多形性球形粒子，直径70～120 nm（平均100 nm），不分节段的单股正链RNA[4]，有囊膜，外周镶嵌着12～24 nm的突起，突起末端呈球状或花瓣状，规则地排列成皇冠状[5]。自1973年美国Mebus等人首次报道该病原以来，随后证明BCV在世界范围内广泛分布[6]，在许多国家和地区牛群中流行[3]。1987年，国内有学者报道在我国牛群中也流行该病[5]。该病在犊牛和成年牛中均可流行，且无季节性。对于我国而言，随着近年来养牛业的迅速发展，牛病毒性腹泻的发病率呈上升趋势，死亡率较高，给养牛业带来了巨大的经济损失[7-8]。实验室于2014年6月从黑龙江省某集约化奶牛场采集因腹泻、脱水死亡的犊牛小肠样本，分离出牛冠状病毒，并对其进行了HE基因的克隆和序列分析，以便了解黑龙江省牛冠状病毒的变异和进化情况。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品采集

2014年6月，样品采集自黑龙江省某集约化奶牛场生前有腹泻症状的病死犊牛的小肠部分，在-20℃条件下保存送至实验室。

1.1.2 引物设计

根据GenBank上发表的BCV毒株HE基因核苷酸序列，利用Premier 5.0软件设计引物，引物序列如下：bCoHE-F（上游引物）：5' AAGAAGACTAAACTCA GTGAAAATG 3'，bCoHE-R（下游引物）：5' CATGTTTAGATTATGGTCTAAGCAT 3'。退火温度50℃，扩增长度1 300 bp。

1.1.3 生化试剂及试剂盒

2×Premix PCR Taq、6×DNA Loading Buffer、RTPCR试剂盒、DNA Marker（2 000）、pMD-18T载体购自TaKaRa公司，蛋白酶K购自德国Merck公司，琼脂糖购自OXOID公司，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自Solarbio公司。

1.1.4 实验试剂

电泳缓冲液，氨苄青霉素，IPTG，氨苄青霉素LB平板，SOB培养基，含氨苄青霉素的LB液体培养基，质粒提取溶液（SolutionⅠ，SolutionⅡ，SolutionⅢ），琼脂糖，DH5α感受态细胞。

1.2 试验方法

1.2.1 临床病料样品处理与RNA提取

将临床采集到的犊牛小肠病料剪下一小块充分研磨，与PBS（PH值为7.2）进行1∶500稀释，4 200×g 10 min离心，取上清液，进行0.22 μm微孔滤器过滤，收集滤液保存在-20℃冰箱备用。参照病毒基因组RNA快速提取试剂盒说明书提取临床样品的基因组RNA。

1.2.2 RT-PCR及鉴定

以提取的临床样品基因组RNA为模板，参照RT-PCR扩增试剂盒说明书进行RT-PCR扩增反应。RT-PCR反应体系为50 μL，RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳及凝胶成像系统扫描进行鉴定。RT-PCR反应体系如下：MgCl22 μL，10×RT Buffer 1 μL，RNase Free dH2O 2.75 μL，dNTP Mixture 1 μL，RNase Inhibitor 0.25 μL，AMV Reverse Transcriptase 0.5 μL，R-Primer 1 μL，Positive Control RNA 1.5 μL，5×Buffer10 μL，H2O 28.75 μL，Ex Tap HS 0.25 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL。30℃10 min，50℃30 min，95℃5 min，5℃5 min，进行1个循环。

1.2.3 目的基因胶回收

参照胶回收试剂盒将剩余RT-PCR产物回收。

1.2.4 目的基因的克隆

将目的基因连接到PMD-18T载体。在16℃条件下，16 h后获得连接产物。将所得产物转入DH5α， 37℃培养16 h。

1.2.5 菌落PCR与测序

以单菌落为模板进行PCR鉴定，将阳性菌落扩大培养，测序。菌落PCR反应体系如下：上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，模板1 μL，2×Pre mix Taq酶12.5 μL，加去离子水补至25 μL。

1.2.6 比对分析与进化树的构建

将HE基因的序列命名并与GenBank上已发表参考株的HE序列用DNAMAN及Clustal X软件进行分析比对，以比较核苷酸序列和氨基酸序列的同源性。GenBank数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov），已发表的15个参考株的HE序列序列获取号如下：

2 结果

2.1 HE基因的扩增

病料用特异性下游引物进行RT-PCR扩增后，经1%琼脂凝胶电泳，可以获得预期大小的片段（见图1）。

图1 HE基因的扩增Fig.1Amplification of HE gene

2.2 测序结果

经博仕生物公司测定，牛冠状病毒HE基因的核苷酸序列长度为1 300 bp，现已将序列提交到Gen－Bank，登录号：KM985632。

2.3 同源性比较及系统进化树构建、分析

用MEGA 4软件将其与加拿大（登录号：AF230528，AF239308S1），美国（登录号：AF391542，AF391541，AF058944，EF424617），韩国（登录号：EU401976，DQ016118S1，HM573325，HM573321），意大利（登录号：EU019216，EF445634），香港（登录号：KF906250），日本（登录号：AB354579）共14种已发表的参考株的HE基因进行同源性比较，构建进化树，结果见图2、3。

图2 牛冠状病毒HE基因的同源性比较Fig.2Homology comparison of bovine coronavirus HE gene

图3 牛冠状病毒HE基因的进化树Fig.3The evolutionary tree of bovine coronavirus HE gene

3 讨论

牛冠状病毒主要感染牛和水牛，人也可以发病，乳用犊牛感染多见于1～90日龄，腹泻常发生于7～10日龄内，肠炎的严重程度与犊牛的日龄、免疫状况、病毒毒株和感染剂量有关[9]。饲养管理差、寒冷、潮湿等可促进本病的发生[9]。病毒侵入宿主体内，首先感染小肠近侧端，然后向下扩散至整个小肠和大肠，肠黏膜上皮发生死亡、脱落[5]。组织学检查可见小肠绒毛缩短，结肠的上皮细胞由正方形变成短柱形[9]。进行免疫荧光检测，可在肠黏膜上肠腺的上皮细胞中发现有冠状病毒荧光[9]。消化道和呼吸道是本病的主要传播途径。根据感染部位和临床症状的不同，BCV可分为牛肠道冠状病毒（BECV）和牛呼吸道冠状病毒（BRCV）[10]。病毒、细菌、寄生虫等病原微生物感染或饲料管理、营养、环境变化等多种因素均能引起牛腹泻性疾病，在诸多因素中病毒性病原微生物感染是引起牛腹泻的重要因素，造成的危害也最为严重[11]，常见疾病如新生犊牛腹泻（CD）和成年牛冬季血痢（WD）等[5]。

实验室采自的牧场，牛群状况如下：0～2月龄犊牛发生严重腹泻，粪便呈胶冻样，粪便中有脱落的消化道黏膜，犊牛精神沉郁，躺卧不起，有严重的脱水现象；剖检见小肠肠道出血，肠壁变薄。0～2月龄犊牛共有50头，发病43头（发病率86%），死亡39头（病死率90.7%）（26 heifers，13bulls），存活4头。样品采自发病剖检牛小肠部分，检测结果显示是牛冠状病毒单一感染，排除牛轮状病毒、牛肠道病毒和牛病毒性腹泻的感染。通过对牛冠状病毒黑龙江毒株HLJ-14的HE基因的克隆与测序，表明基因组全长为1 300 bp，且其全序列符合HE基因型参照序列特点，与GenBank中已发表的另外14株BCV HE基因型全序列同源性为97.3%～98.8%。进一步序列测序与比较，制成进化树（图3）。进化树中将15株牛冠状病毒HE基因分为三大组，来自香港1株（KF906250）及日本1株（AB354579）为第一组（Ⅰ），来自意大利的两株（EU019216和EF445634）为第二组（Ⅱ），其他的11株为第三组（Ⅲ）。结果发现，在第一组中，来自香港的KF906250与来自日本的AB354579分属进化距离较远。在第二组中，来自意大利的两组毒株EF445634和EU019216分属进化距离最近。在第三组中，来自中国的KM985632与来自韩国的HM573325，HM573321，EU401976和DQ016118S1分属进化距离较近；来自加拿大的AF230528和AF239308S1分属进化距离近，其次是来自美国的AF391542，之后是来自美国的AF391541和EF424617，但与AF058944（美国）稍远。这说明各个国家牛的来源不同，其病毒的传入与迁移也不同，病毒在具有不同遗传和免疫特质的宿主中的长期选择是形成BCV同一基因型病毒进化基因不同的原因之一。随着新型冠状病毒的不断出现，弄清病毒的形态结构在研究病毒进化过程中有巨大作用，而蛋白质的氨基酸序列是由对应基因所编码的，所以对血凝素酯酶蛋白（HE基因）的研究在冠状病毒的流行病学调查中有重要意义。

［1］Clark M A.Bovine coronavirus［J］.Br Vet，1993，149：51-70.

［2］Savithra D S，Martin A H，Joanne I，et al.The Nucleocapsid protein gene of bovine coronavirus is bicistronic［J］.J Virol，1992，66（9）：5277-5283.

［3］杨晓芳，沙涌波.牛冠状病毒感染［J］.动物医学进展，2004，25（3）：116-117.

［4］Takiuchi E，Stipp D T，Alfieri A F，et al.Improved detection of bovine coronavirus N gene in feces of calves infected naturally by a semi nested PCR assay and an internal control［J］.J Virol Meth，2005，131（2）：148-154.

［5］毕艳铎，魏晓曼，冉旭华，等.猪轮状病毒重组VP8*蛋白的原核表达及免疫原性分析［J］.黑龙江八一农垦大学学报，2015，27（6）：28-30.

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［7］武迎红，张久华，王俊杰，等.羊传染性脓疱病的诊断和治疗［J］.内蒙古民族大学学报：自然科学版，2014，29（6）：73-74.

［8］谷城，武瑞，孙东波，等.黑龙江东部某牛场泌乳牛跛行调查及其与产奶量、胎次和干物质采食量的关系研究［J］.黑龙江八一农垦大学学报，2015，27（2）：41-45.

［9］叶树华.牛冠状病毒的防治［J］.兽医卫生，2008（6）：39.

［10］殷震，刘景华.动物病毒学［M］.2版.北京：科学出版社，1997.

［11］权英存，刘虎守.青海省部分地区3种牛病毒性腹泻病原的感染情况调查［J］.中国畜牧兽医，2014，41（5）：220.

Cloning and Analysis of the Evolutionary Tree’s of Bovine Coronavirus HE Gene

Wei Shan，Gu Cheng，Li Chunqiu，Bian Xiudong，Sun Xiaoxuan，Gao Hongquan，Xing Yuxin，Zhang Pengyu，Zhang Lichun，Sun Dongbo
（College of Animal Science and Veterinary Medicine，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

The bovine coronavirus nucleic acid was extracted to study the bovine coronavirus HE gene evolution.The RNA was transcribed reversely into cDNA which was amplified as a template to a length of 1 300 bp HE gene fragment，connected with pMD-18T vector，cloned into DH5α.It was sequenced and analysed the evolution tree with 14 strains BCV HE gene of the sequences published in GenBank.Amplification of bovine coronavirus HE gene sequence（HLJ-14），according with the characteristics of the HE genotype reference sequence，and GenBank had been published in the other 14 strains of BCV HE gene sequence homology of 97.3%-98.8%.

bovine coronavirus;HE gene;clone;the evolutionary tree

S435.21

A

1002-2090（2017）04-0020-04

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.04.005

2016-12-15

黑龙江省高校新世纪优秀人才计划（1252-NCET-016）。

魏姗（1993-），女，黑龙江八一农垦大学动物科技学院2015级硕士研究生。

孙东波，男，教授，硕士研究生导师，E-mail：dongbosun@126.com。