脂磷壁酸对小鼠乳腺组织TLR2表达的影响

张安，赵佳琦，李晓婷，单旭菲，杨彬

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319）

脂磷壁酸对小鼠乳腺组织TLR2表达的影响

张安，赵佳琦，李晓婷，单旭菲，杨彬

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319）

为了研究脂磷壁酸对小鼠乳腺组织TLR2表达的影响，试验采用小鼠为模型，用不同剂量的LTA对小鼠乳腺进行灌注，采用组织切片方法观察小鼠乳腺组织的病理组织学变化，Real-time PCR方法检测乳腺组织中TLR2以及炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA的表达变化。结果表明，对照组乳腺腺泡正常，灌注LTA乳腺腺泡壁增厚，乳腺腺泡有中性粒细胞的浸润。TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表达水平比未注射LTA小鼠显著升高（P＜0.05）。结果表明TLR2介导的信号途径能够使炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6表达。

小鼠；乳腺组织；脂磷壁酸；TLR2

奶牛乳腺炎是一种主要由病原菌感染引起的一种复杂性疾病，是影响世界奶牛业健康发展的最主要疾病之一。引起奶牛患乳腺炎的病原微生物主要有大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌及停乳链球菌[1-2]，脂磷壁酸是革兰氏阳性菌特征性的膜结合聚合物[3]。脂多糖LPS常被用作模拟大肠杆菌来诱导实验性体外和体内乳腺炎，而LTA（lipoteichoic acid，LTA）常被用作模拟金黄色葡萄球菌来诱导实验性体外和体内乳腺炎[4-5]。

TLR是一类细胞表面的天然免疫受体，主要表达于免疫细胞和上皮细胞。宿主天然免疫系统主要通过位于细胞膜或胞内体膜上的TLR来识别和监测入侵的病原微生物，并对它们的刺激做出反应。病原相关分子模式PAMPs激活TLRs信号通路，产生I型干扰素、炎症细胞因子和趋化因子，同时也诱导树突状细胞的成熟，启始适应性免疫反应[6]。TLR的配体能够作为免疫佐剂影响适应性免疫反应[7]。TLR2能特异性识别革兰氏阳性菌成分，包括脂磷壁酸（lipoteichoic acid，LTA）。TLR信号激活后，引起NF-κB和MAPK表达增加，调节各种免疫和炎症介质的基因表达，包括TNF-α、IL-1及IL-6[8]。研究发现TLR2可以作为奶牛乳腺炎候选基因，应用于乳腺炎抗性分子标记辅助选择育种[9]。TLR2过表达转基因羊为研究TLR2在防卫细菌侵染中的作用提供了一个理想的模型[10]。

研究以小鼠为模型，采用不同浓度的LTA灌注小鼠乳腺，观察小鼠乳腺组织的病理组织学变化，检测乳腺组织中TLR2以及炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达变化，为TLR2介导的乳腺炎炎性信号通路的研究提供一定的依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

BALB/c小鼠购自长春市生物制品研究所；LTA购自InvivoGen公司；RNA提取所用Trizol购自Invitrogen；反转录试剂盒购自Takaka公司；实时定量PCR试剂盒购自Bio-Rad公司。

1.2 小鼠乳腺灌注

将6～8周龄雌鼠和雄鼠合笼饲养，当发现雌鼠怀孕，将怀孕雌鼠进行分组实验，怀孕雌鼠产后用乙醚进行麻醉，对实验组小鼠的乳腺灌注LTA（按照1 μg、5 μg、10 μg剂量），LTA溶解于生理盐水，每个剂量6只，对照组灌注生理盐水，各注射组都灌注到第4对乳腺。灌注12 h后将小鼠处死并且采集乳腺，将一侧乳腺用甲醛固定液固定后，经过脱水、透明、包埋、切片、HE染色等步骤，将切片置于显微镜下观察与照相；另一侧乳腺冻存于液氮中，用于提取RNA。

1.3 荧光定量PCR检测

按照Trizol法提取组织总RNA，用NanoDrop2000超微量分光光度计测定RNA浓度及RNA的OD值后反转录为cDNA后，用荧光定量PCR试剂盒对反转录的cDNA进行扩增，以内参β-actin进行目的基因相对表达量的计算。

表1 荧光定量PCR用到的引物和序列Table 1Primers and sequences for Real-time PCR

1.4 统计分析

采用统计软件SPSS17.0对荧光定量PCR数据进行单因素方差分析，P＜0.05或P＜0.01为具有统计学差异。

2 结果

2.1 小鼠乳腺的病理组织学变化

将LTA按不同剂量灌注小鼠乳腺，灌注12 h后，对照组乳腺腺泡正常，未出现病理变化，腺泡腔内可见乳汁；灌注1 μg LTA乳腺腺泡壁增厚，乳腺腺泡有少量中性粒细胞的浸润；灌注5 μg和10 μg LTA乳腺腺泡壁增厚，乳腺腺泡有大量中性粒细胞的浸润（图1）。

2.2 LTA对小鼠乳腺组织中TLR2、TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表达的影响

采用荧光定量PCR方法对小鼠乳腺组织中TLR2、TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA表达水平进行检测，结果显示，与对照组相比，不同剂量LTA灌注小鼠乳腺中TLR2、TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA表达水平显著升高（P＜0.05），并且表达水平随剂量的增加而升高（图2）。

图1 不同剂量的LTA注射小鼠乳腺后炎性细胞增多Fig.1 Inflammatory cells increased in the mammary glands of mice after different doses of LTA infusion

图2 不同剂量的LTA灌注小鼠乳腺后TLR2、TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA的相对表达量Fig.2Relative expression of TLR2，TNF-α，IL-1β and IL-6 mRNA in the mammary glands of mice after different doses of LTA infusion

3 讨论

国内外研究发现Toll样受体在奶牛乳腺炎发病过程中起重要作用，临床乳房炎奶牛的乳腺组织中TLR4、TNF-α和IL-1β的表达水平比健康奶牛的表达水平显著升高[11]。用大肠杆菌人工感染小尾寒羊乳房结果发现感染大肠杆菌后乳腺组织中TLR4的表达明显上调[12]。用金黄色葡萄球菌诱导大鼠乳腺炎模型发现TLR2、TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA表达水平显著升高[13]。研究用LTA灌注小鼠乳腺发现炎性细胞的浸润及炎性细胞因子表达水平的明显升高，表明乳腺发生感染时，乳腺组织分泌的炎性细胞因子促进炎性细胞迁徙到乳腺腺泡当中。

TLR2是革兰氏阳性菌及其病原相关分子模式LTA的特异性受体。用金黄色葡萄球菌LTA灌注奶牛乳腺发现能够诱导乳腺趋化因子及炎性细胞因子的升高[14-15]。试验用不同剂量金黄色葡萄球菌LTA灌注小鼠乳腺组织后，乳腺组织中TLR2 mRNA的表达水平均显著升高，且TLR2表达升高与乳腺组织损伤及炎性细胞因子的释放密切相关，这表明TLR2信号途径在金黄色葡萄球菌乳腺炎发病机制中发挥着重要的作用。

小鼠乳腺炎模型能够用来监测宿主免疫应答、乳腺炎的发生、发展及转归，小鼠乳腺炎模型与大动物模型相比具有用时短、高效、节省成本等优点，而且近交系小鼠具有相同的基因，降低了动物之间的差异[16]。革兰氏阴性菌脂多糖LPS作为一种诱导小鼠乳腺炎的常用内毒素，而且LPS能够通过TLR4的途径激活NF-κB[17-18]。在金黄色葡萄球菌诱导心肌功能障碍的研究中发现LTA能够诱导TLR2野生型小鼠心脏TLR2的上调，并且激活NF-κB，使细胞因子的表达升高，而在TLR2缺失小鼠中没有这些效应。这些研究结果与研究的LTA能够引起小鼠乳腺TLR2及炎性细胞因子表达的升高相一致[19]。

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Effect of Lipoteichoic Acid on TLR2 Expression in Mammary Tissue of Mice

Zhang An，Zhao Jiaqi，Li Xiaoting，Shan Xufei，Yang Bin
（College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

In order to investigate the effect of lipoteichoic acid（LTA）on TLR2 expression in mammary tissue of mice，mice were used as model，and mammary infusion was taken with different doses of LTA.Tissue section method was used to observe pathological histological changes in mammary tissue.Real-time PCR was used to detect TLR2，TNF-α，IL-1β and IL-6 mRNA in mammary tissue after LTA infusion.The results showed that the mammary alveolars of control group were normal，perfusion LTA mammary gland bubble wall thickening，inflammatory cells increased in mammary tissue after LTA infusion.The expression levels of TLR2，TNF-α，IL-1β and IL-6 mRNA significantly increased in LTA infused mammary gland（P＜0.05）.The results indicated that TLR2 mediated signal pathway could lead to the inflammatory cytokine expression.

mice；mammary tissue；lipoteichoic acid；TLR2

S852.3

A

1002-2090（2017）04-0024-04

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.04.006

2016-12-15

黑龙江八一农垦大学动物科技学院大学生创新创业训练计划项目。

张安（1995-），女，黑龙江八一农垦大学动物科技学院动物医学专业2013级本科生。

杨彬，男，讲师，E-mail：yangbin_nm@126.com。