基于MicroRNAs的锁核酸抗肿瘤基因治疗新进展

肖树荣+许桂丹+邓益斌

【关键词】锁核酸；MicroRNAs；肿瘤；治疗

中图分类号：R730.54 文献标识码：ADOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2017.04.027

肿瘤是一种涉及编码或非编码基因结构和表达异常引起的疾病。MicroRNAs（miRNAs）调节蛋白质编码基因和其他非编码转录的表达，被认为是细胞生理活动的主要调控物之一，过去十几年针对miRNAs研究很多。目前认为，miRNAs的异常调节，很大程度上影响基因的表达，并且与许多疾病相关，特别在肿瘤的发生、发展和转移中起着重要的作用。miRNAs在癌症生物学和肿瘤学中被广泛研究，给我们带来大量关于miRNA在肿瘤细胞的病理生理学、肿瘤与miRNA失衡的相关信息。在肿瘤细胞内调控miRNA水平的治疗策略向临床前和临床期新治疗方法发展。锁核酸（locked nucleic acid，LNA），本质是一种核苷酸衍生物，因其具有的亲和性、热稳定性、抗酶切性等优势，被广泛应用于各种疾病治疗中，特别是基于miRNAs在肿瘤治疗中已被大量研究并取得一定成果。虽然现在针对miRNA治疗策略有一定的局限性和障碍，但越来越多的研究成果不断克服这些障碍，使这种治疗策略具有可行性。现就此综述如下。

1miRNAs的生物活性

miRNAs是一种内源性小（21～24 nt）单链非编码RNAs，在细胞内主要的功能是转录后调控mRNAs翻译[1]。miRNAs开始的生物合成在细胞核。初级miRNA（pri-miRNAs）由RNA聚合酶Ⅲ和聚合酶Ⅱ转录形成，进一步被核糖核酸酶Drosha和DGCR8蛋白切割形成前体miRNA（pre-miRNAs）。pre-miRNAs接着从细胞核通过转运蛋白Exportin5运到细胞质。在细胞质核酸内切酶Dicer和TRBP蛋白相互作用下，成熟的miRNAs被合成，双链结构被重新整理，引导链与Argonau和其他蛋白形成miRISC复合体，在基因表达中起到积极作用[2]。另外一条链，也即是随从链，常在细胞质被降解，或者存留，并发挥自己具有的生物活性。

2作用机制

miRNAs主要与mRNA的3非翻译区（3-UTR）结合，少数能结合于5非翻译区（5-UTR），或自身的编码序列。RNA沉默机制中，在不完全匹配的情况下，mRNA：miRNA杂交体翻译被抑制或翻译不完全，多肽链随后被降解。miRNAs结合于目标mRNA也激活mRNA末端的3-poly（A）脱腺苷化，这是mRNA第一步去稳定化和随后被5和3核酸外切酶降解。mRNA：miRNA杂交体在完全匹配的情况下会直接切割目标mRNA，但一般在动物细胞不完全匹配是最普遍的，而完全匹配主要存在于植物细胞。miRNAs种子序列确保结合的特异性，其包含6～8 nt和种群上非常保守。一种miRNAs能调控多种不同的基因，而且超过50%的基因被miRNAs调控，因此，miRNAs通过基本代谢维持、分化、分裂、增殖到死亡，影响大多数细胞进程。在肿瘤组织，大多数的miRNAs水平发生变化，miRNAs减少我们称之为肿瘤抑制物，反之，在肿瘤细胞中大量的表达为致癌miRNAs。一些细胞实验和动物实验结果证明通过增加特异性miRNAs肿瘤抑制物水平或减少致瘤miRNAs水平，可以逆转miRNAs水平回归生理平衡，从而达到治疗的目的[3]。

3锁核酸的化学结构与理化性质

3.1化学结构锁核酸（locked nucleic acid，LNA）也称桥核酸，是一种化学结构较特殊的双环状高亲和性RNA衍生物，其分子结构中含有一个或多个 2 -O，4 -C-亚甲基-β-D-呋喃核糖核酸单体。核糖结构的 2 -O 位和 4 -C 位由于缩水作用不完全相同，可以形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥三种亚甲基桥，并连接成环形，形似锁状或桥状，因此而得名。这个环形桥锁定了呋喃糖C3 - 内型的N构型，降低了核糖结构的柔韧性，增加了磷酸盐骨架的局部结构的稳定性[4]。LNA 的特殊构象能够导致核酸骨干的预组装，在某种程度上增加碱基堆积力，有利于双链形成[5]。

3.2理化性质正是因为LNA化学结构上的特殊构象原因，使其理化性质比其他寡核苷酸具有以下的六个优势更突出：（1）LNA具有水溶性好的特性，能自由出入细胞，易被机体吸收。（2）明显改善抗核酸酶切割能力：血液中siRNA极不稳定，未修饰的siRNA易被大量的核糖核酸酶迅速分解。有研究证明，在siRNA 3末端被LNA单体修饰后，siRNA抗核酸酶切割能力和在血清中的半衰期明显提高[6]。（3）LNA与DNA或RNA结合时，错配辨别力更强。（4）与互补序列的杂交高亲和性：因为LNA碱基与互补DNA、RNA的磷酸盐骨架相同，不但使得杂交时具有更高亲和力，而且这种相同的磷酸盐骨架能使互补序列容易被LNA识别，从而容易形成高亲和力的杂交物。（5）與互补双链的热稳定性增加：LNA单体修饰到寡核苷酸链中时，能明显提高其解链温度（Tm）。有研究证明，在LNA 与DNA形成的杂交双链后，Tm可提高2℃～6℃，而在与RNA形成的杂交双链中，Tm可提高3℃～9℃[7]，可见明显增加与互补双链的热稳定性。（6）LNA的无毒性：LNA注射进小鼠体内后，对其做毒副作用检测（肝肾功能生化指标和病理检查），未发现有明显变化和病理改变[8～9]。正是因为LNA所具有的这些优势，近年来在肿瘤基因治疗中，LNA成了学者的研究热点。

4锁核酸在基于miRNAs治疗肿瘤

4.1LNA修饰反义miRNAsmiRNAs不仅与肿瘤发展、分化、凋亡和增殖等生物进程有关，而且其表达图谱与肿瘤病人的阶段、进程、预后呈相关性。miRNA与目标mRNA生物活性功能的发挥是通过Watson-Crick碱基配对原则相互结合。因此，如果设计一种反义寡核苷酸互补于miRNA，并与之牢固结合，使其不能有效结合于靶标mRNAs，那么就可以阻断miRNAs对mRNAs的调控，从而有效抑制mRNA功能活性，这种治疗方法就是反义治疗。反义寡核苷酸治疗策略依靠RNase H及其他机制成功用于抑制基因的表达在十多年前已经报道。然而，要使反义寡核苷酸高效、特异、完好地到达细胞内目标部位，必须经过有效的修饰。虽然反义治疗策略从概念理解是一种简单、易操作的可行方法，但许多因素影响寡聚物与靶标之间的相互作用。其中的因素主要包括RNA靶标的结构特征，寡聚物杂交的亲和性，抗核酸酶的降解能力，与靶标RNA相互作用的机制，这些因素都会决定反义治疗成败，因此必须考虑这些因素才能获得满意的结果。LNA寡核苷酸用脂质体、半乳糖配体载体等技术成功地转染进细胞内，他们序列特异、无毒性和提高细胞内的抗核酸酶能力，使在反义治疗诱导基因沉默更有效。另外，LNA拥有重要的物理化学性能，能为有效和安全的药物提供更广阔的发展空间。除此之外，对RNA目标分子还具有高效能，高亲和力，容易被细胞摄取和生物分布的优势。不管是反义抑制mRNAs还是其他沉默的方法，在RNA-DNA杂化双链，要有效地抑制目标mRNA需要激活RNAse H，这种酶能有效切割RNA。此外，完全修饰LNA寡核苷酸不能降低RNAse H的活性。LNA一般位于寡核苷酸的末端，中间部分DNA序列至少有8个核苷酸是未修饰的，这样有利于RNAse H切割目标mRNA[10～11]。除了LNA外，其他有效修饰anti-miRs的还有硫代核苷酸和肽核酸等。但在这些核苷酸修饰物中，LNA与互补目标RNA拥有更高的亲和力，因此LNA-anti-miRs更适合应用于miRNA的靶向治疗。endprint

4.2LNA-antimiRs在肿瘤中的治療应用利用LNA修饰反义miRNAs（LNA-anti-miRs）下调相应miRNAs的表达量而起到干预治疗肿瘤的目的，这个治疗策略的有效性在各种肿瘤中均有报道。M Sharifi等[12]在急性巨细胞白血病细胞系（M-07e）用LNA-anti-miR92a-3p转染阻断miR-29a-3p表达并研究细胞增殖、凋亡和坏死情况，结果发现在转染LNA-anti-miR92a-3p后的三个时间点，经检测miR-92a-3p的表达量减少后，细胞的凋亡率、坏死率相应增加，与对照组比较差异有统计学意义，证明阻断miR-92a-3p表达可以诱导急性巨细胞白血病细胞凋亡和坏死。相似的，在急性早幼粒白血病细胞系（HL-60）用LNA-anti-miR92a抑制miR-92a后诱导细胞凋亡，可广泛减弱细胞的生存能力[13]。在结肠恶性腺瘤中miR-21明显升高，针对这个研究背景，R Nedaeinia等[14]设计LNA-anti-miR-21靶向抑制miR-21表达诱导基因沉默。在结肠癌LS174T细胞系转染LNA-anti-miR-21后，结果发现miR-21的表达量减少，侵袭能力减弱，生存能力降低并诱导细胞的凋亡。LNA-anti-miRs不仅在细胞实验中取得了良好效果，在小鼠体内实验也证明了方法的有效性。在鼻咽癌细胞和组织中MiR-214过度表达。Zhang Z-C等[15]在细胞实验中用LNA-anti-miR-214沉默MiR-214后导致促进细胞凋亡和抑制细胞的增殖，在裸鼠体内实验时，发现肿瘤的生长受到有效抑制，证明MiR-214在鼻咽癌起到重要作用。髓母细胞瘤（MB）起源于小脑，是儿童脑部最常见的恶性肿瘤。高表达miRNAs被miR-17～92 和miR-106b～25族编码。Brian L.Murphy等[16]用LNA-anti-miR的治疗，发现肿瘤细胞miR-17 和miR-19a分别被antimiR-17 和 antimiR-19抑制后，在体外肿瘤细胞的增殖能力减弱。同时用antimiR-17 和 antimiR-19治疗小鼠，不仅减慢肿瘤的生长速度而且能延长颅内移植小鼠的生存率。miR-221/222在多发性骨髓瘤（MM）t（4；14）易位病人中恶性浆细胞过度表达，Di Martino MT等[17]采用LNA-i-miR-221观察抗肿瘤效果，结果显示在体外LNA-i-miR-221具有很强的对抗活性抑制miR-221和诱导内源性目标p27Kip1下调，有明显的抗增殖作用。在体内LNA-i-miR-221引起明显抗肿瘤活性对抗t（4；14）MM移植瘤，也诱导miR-221下调，上调p27Kip1，减少Ki-67，治疗后在相关器官未发现毒性改变。

4.3耐药敏感miRNA在各种恶性肿瘤药物耐药的产生中起着关键作用。尤其是在调控药物流出转运蛋白、诱导细胞凋亡、细胞周期、DNA修复机制和其他改变药物目标作用更突出。例如他莫西芬是一种对雌激素受体阳性（ER+）乳腺癌病人有效的抗雌激素治疗药物，然而，常常会观察到他莫西芬耐药的出现。其耐药潜在的分子机制与某些miRNA（如miR-190b 和 miR-516a-5p）介导调控ESR1，PGR1，FOXM1 和 14-3-3家族的基因有关，这些基因的失调控可能产生他莫西芬耐药[18]。因此，对miRNA进行调控有可能改善药物耐药情况，国内外对此做了大量研究。顺铂（cisplatin，DDP）是肺癌最有效的化疗剂之一，被广泛用于一线化疗，然而长期用药容易产生耐药。有研究[19～20]设计合成LNA-anti-miR-21和LNA-anti-miR-196a抑制相应的miRNA生成，观察miRNA-21、miRNA-196a在非小细胞肺癌体内和体外敏感性，当下调miRNA-21、miRNA-196a时DDP在肺癌细胞的化学敏感性提高，反之，上调时则降低DDP化学敏感性，实验证明miRNAs在药物抵抗中起着关键作用。另有研究[21]证明LNA-anti-miR-221能逆转美法仑（melphalan）在多发性骨髓瘤前临床模型中药物抵抗，为临床实验克服药物抵抗和提高多发性骨髓瘤病人的预后提供理论依据，更重要的是在治疗的小鼠体内没有找到毒性和副作用的证据。

5LNA-anti-miR药物动力学和安全性

LNA-anti-miR用于细胞和小鼠短期能有效抑制miRNA生成，并成为人类疾病有前途的治疗靶标，在体内体外实验对肿瘤的治疗起到了一定的作用。但是这个方法在高等动物（比如人类和非灵长类动物）长期有效性和安全性并没有得到证明，因此对其需进一步的研究。在鼠和猴血浆、尿液、及组织评估LNA-anti-miR-221药物动力学和药效学，结果发现LNA-anti-miR-221在鼠和猴半衰期短、尿液排泄率低。直到第3周，随着p27上调，LNA-anti-miR-221仍然在鼠重要器官和肿瘤中检测到，并且猴子没有观察到毒性反应[22]。皮下给药LNA-anti-miR非灵长性动物超过108天的治疗表现出好的耐受性[23]。研究这些数据在非灵长类动物代谢疾病模型证明LNA-anti-miR对抗miRNAs的有效性和安全性，表明LNA-anti-miR适合于临床的应用和人类疾病的治疗。

6问题与展望

基于调控miRNA治疗肿瘤策略具有较高的特异性和靶向性，使之可能成为一种具有美好前景的治疗肿瘤的方法。然而，在此基础上，要达到更高敏感性和特异性，加快这种治疗方法应用到临床仍然要提高他们的化学设计，研究更好的递送方式，延长治疗的有效性，保证在体内长期的安全性。此外，在应用到临床前有必要更深入认识潜在的miRNAs和人类基因组学、转录组学、蛋白组学之间复杂网络调控。总体而言，基于miRNA的治疗可能会带来一个令人兴奋的、新的、面向个体化的医学肿瘤治疗策略。然而，我们必须更深入认识它的生物学知识和其与疾病的关系。endprint

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