幽门螺旋杆菌感染与胃癌组织中p27、CyclinD1、MIF蛋白表达的相关性分析

曹世堂，易小兵，王玉华，杨立宇

(1.白求恩国际和平医院二五六临床部 a.消化内科，b.病理科，c.医务处，河北 石家庄 050800；2.河北医科大学附属第四医院肿瘤内科，河北 石家庄 050081)

幽门螺旋杆菌感染与胃癌组织中p27、CyclinD1、MIF蛋白表达的相关性分析

曹世堂1a，易小兵1b，王玉华2，杨立宇1c

(1.白求恩国际和平医院二五六临床部 a.消化内科，b.病理科，c.医务处，河北 石家庄 050800；2.河北医科大学附属第四医院肿瘤内科，河北 石家庄 050081)

目的探讨幽门螺旋杆菌(Hp)感染与胃癌组织中细胞周期调节因子p27、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、巨噬细胞移动抑制因子(MIF)蛋白表达的相关性。方法收集2012年3月至2017年3月经胃镜与病理检查明确诊断的胃癌标本60例，根据是否发生Hp感染分为Hp阳性组、Hp阴性组各30例，另以正常胃黏膜组织20例为正常黏膜组，采用免疫组织化学法检测三组p27、CyclinD1、MIF蛋白表达水平，并分析其与胃癌患者临床病理特征及与Hp感染的相关性。结果Hp阳性组p27阳性率低于Hp阴性组和正常黏膜组，CyclinD1、MIF蛋白表达水平高于阴性组和正常黏膜组(P< 0.05)，Hp阴性组与正常黏膜组上述指标差异也有统计学意义(P< 0.05)；p27、CyclinD1、MIF表达水平与临床分期、肿瘤浸润深度、肿瘤分化程度有关(P< 0.05)；胃癌患者Hp感染与p27表达水平呈负相关，与CyclinD1、MIF表达水平呈正相关，且p27与CyclinD1、MIF水平呈负相关性(P< 0.05)。结论幽门螺旋杆菌感染与胃癌组织中p27、CyclinD1、MIF蛋白表达水平存在一定相关性，p27、CyclinD1、MIF可能参与胃癌发生发展。

幽门螺旋杆菌感染；胃癌癌组织；p27；CyclinD1；MIF；相关性

幽门螺杆菌(Hp)已被确诊为1类胃癌致病因子，是慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌及胃黏膜淋巴样淋巴瘤的主要病原体，分析与胃癌患者Hp感染相关的生物学标志物对控制胃癌进展及探讨治疗靶点有重要意义[1，2]。p27、CyclinD1、MIF均是细胞周期调控蛋白，参与多种癌症发生发展，因此分析p27、CyclinD1、MIF在胃癌、胃癌合并Hp感染中的表达水平及相关性有重要意义[3，4]。本文分析Hp感染与胃癌癌组织中p27、CyclinD1、MIF表达水平的相关性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料收集2012年3月至2017年3月我院经胃镜与病理检查明确诊断的胃癌标本60例，经4%中性福尔马林固定、常规石蜡包埋，4 μm连续切片作免疫组化标记及革兰染色使用，所有取材标本的患者均未接受放化疗治疗，进行胃镜检查前近2周内无抗Hp药物使用史或服用非甾体抗炎药物史，同时排除合并其他系统恶性肿瘤者。另取距胃癌患者癌组织边缘5 cm以上经病理证实正常的胃黏膜20份，作为正常黏膜组。按是否合并Hp感染将胃癌标本分为Hp阳性组和Hp阴性组各30例，Hp阳性组男18例，女12例；年龄32～67岁[(49.10±0.15)岁]；组织分化程度：高度分化10例，中度分化11例，低分化9例；P-TNM分期Ⅰ+Ⅱ期12例，Ⅲ+Ⅳ期18例，Hp阴性组男17例，女13例；年龄30～68岁[(49.13±0.12)岁]；组织分化程度：高度分化8例，中度分化8例，低分化14例；P-TNM分期Ⅰ+Ⅱ期13例，Ⅲ+Ⅳ期17例，两组一般资料比较差异无统计学意义(P> 0.05)，具有可比性。本研究经医学伦理委员会批准，且标本采集得到患者知情同意。

1.2试剂来源采用13C呼气试验及Giemsa染色法检测Hp感染，PCR引物由上海生工生物工程有限公司设计，RT-PCR试剂盒选用Fermentas公司(合肥志宏生物技术有限公司代理)，2% Giemsa染液由北京中杉金桥生物技术有限公司提供，免疫人多克隆抗体p27、CyclinD1、MIF(浓缩型)购自Santa Cruz公司(北京中杉金桥生物技术有限公司代理)，即用型非生物素Elivision plus免疫组化试剂盒(产品编号为KIT-9901)、DAB显色试剂盒(DAB-0031)购自福州迈新生物技术开发公司。

1.3检测方法

1.3.1Hp检测 应用13C呼气试验，采用13C标记尿素，空腹达6 h后开始集呼气100 ml，口服13C-尿素后，收集100 ml待测气，收集完毕，连接13C红外线能谱仪检测孔，自动检测，生成报告，以DOB值>2.5为阳性。组织切片进行改良Giemsa染色：取活检标本以10%甲醛固定、不同浓度乙醇脱水，后用石蜡包埋、切成厚度约4 μm切片，进行Giemsa染色，将石蜡切片常规脱蜡复水，加入2%Giemsa染色剂染色30 min后，经自来水洗后迅速加入纯酒精内脱水及二甲苯透明，以树胶封固，1000倍油镜下观察Hp感染情况。

1.3.2p27、CyclinD1、MIF蛋白表达水平测定 按照试剂盒说明书进行操作，进行脱蜡至水，滴加一抗、二抗，以DAB显色，染色时设阴性对照(以PBS代替一抗)、阳性对照(由试剂公司提供)，p27、CyclinD1、MIF着色部位主要在细胞核，判断标准：阳性：细胞核背景呈清晰棕黄色或棕褐色，阳性细胞数0～5%计0分，6%～20%计1分，21%～50%计2分，>50%计3分，得分0～1分为阴性，2～3分为阳性，所有切片均由两位经验丰富的病理医师应用双盲法进行阅片。

1.3.3Western blot检测 取标本组织，剪碎，加入PMSF后提取总蛋白，以12.5%聚丙烯酰胺凝胶电泳，半干转膜，应用5%脱脂奶粉TT-BS封闭液中封闭1 h，与1∶500稀释的一抗(免疫人p27、CyclinD1、MIF多克隆抗体)结合，4 ℃孵育过夜，室温洗膜，10 min/t，共洗涤三次，再与1∶1000稀释的二抗结合，室温孵育2 h后，TBS-T洗膜30 min三次后，DAB显色，凝胶成像系统拍照，以β-肌动蛋白(β-action)作为内参照，观察结果。

1.4统计学方法采用SPSS 19.0软件处理数据。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t检验；计数资料比较采用χ2检验。相关分析采用秩相关分析。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1p27、CyclinD1、MIF蛋白在不同组织中表达水平分析Hp阳性组p27蛋白表达水平明显低于Hp阴性组和正常黏膜组，CyclinD1、MIF蛋白表达水平高于Hp阴性组和正常黏膜组(P< 0.05)，Hp阴性组与正常黏膜组上述蛋白表达水平差异也有统计学意义(P< 0.05)。见表1，图1，图2。

表1 p27、CyclinD1、MIF蛋白在不同组织中表达水平分析 [n(%)]

*与正常黏膜组比较，P< 0.05；#与Hp阴性组比较，P< 0.05

图1 p27、CyclinD1、MIF蛋白在不同组织中表达病理图 a:p27在胃癌合并感染胃黏膜组织、胃癌胃黏膜组织中低表达；b:p27在正常胃黏膜组织中高表达；c:CyclinD1在胃癌合并感染胃黏膜组织、胃癌胃黏膜组织中高表达；d:CyclinD1在正常胃黏膜组织中低表达；e:MIF在胃癌合并感染胃黏膜组织、胃癌胃黏膜组织中高表达；f:MIF在正常胃黏膜组织中低表达。

图2 Western blot法检测p27、CyclinD1、MIF蛋白在胃癌合并感染胃黏膜组织、胃癌胃黏膜组织、正常黏膜组织中的表达

2.2p27、CyclinD1、MIF蛋白表达水平与临床病理特征分析对比临床病理资料发现，在胃癌患者中，临床分期Ⅲ～Ⅳ期、浸润深度见全层、分化程度高者p27、CyclinD1、MIF蛋白阳性率较临床分期Ⅰ～Ⅱ期、浸润深度未见全层、分化程度低者高(P< 0.05)。见表2。

2.3Hp感染与p27、CyclinD1、MIF表达水平的相关性分析胃癌患者Hp感染与p27蛋白表达水平呈负相关，与CyclinD1、MIF蛋白表达水平呈正相关，且p27与CyclinD1、MIF也存在负相关关系(P< 0.05)，见表3。

表2 p27、CyclinD1、MIF蛋白表达水平与临床病理特征分析 [n(%)]

表3 Hp感染与p27、CyclinD1、MIF表达水平的相关性分析

3 讨论

Hp为1983年Warren及Marshall发现的定植在胃黏膜的革兰阴性螺旋细长微弯杆菌，目前Hp在我国感染率达50%～80%，且呈逐渐增加趋势，该病原体为慢性胃炎感染、胃癌、胃淋巴瘤、消化性溃疡的元凶，被世界卫生组织列为致癌因子之一，常规呼气、内窥镜等检查效率率低，因此早期选择有效生物学指标对其开展诊断有重要意义[5，6]。研究显示胃癌的发生受多种癌基因及抑癌基因调控，肿瘤发生发展与细胞周期调控异常有关，其中Wnt经典信号传导通路在细胞增殖、分化及转移等方面起重要调控作用，所以引起的细胞周期紊乱是肿瘤形成的重要决定因素，而Cyclin CD1是Wnt经典信号通路的重要靶基因，为重要细胞周期蛋白，该蛋白过度表达可能促进细胞异常增殖或持续增殖，促进肿瘤发生发展，研究显示其在胃癌进展、分化、浸润及转移中起着重要作用，是判断胃癌生物学行为的较好指标，但其与胃癌患者Hp感染的相关性较少报道[7～9]。胃癌的发生为多种因子、多步骤相互作用的复杂生物学过程，而MIF是一种在炎症反应、肿瘤发生发展中发挥双重作用的蛋白，为人体内重要多功能细胞因子，可促进细胞转化、肿瘤分裂及增殖，有利于促进肿瘤血管生成，有研究显示胃癌与Hp感染存在相关性，而MIP表达能调控细胞凋亡，对胃癌发生发展有一定促进组作用[10，11]。p27蛋白为细胞周期负性调节因子，其表达在肿瘤性疾病发生中有调控作用，通过与细胞周期依赖性激酶抑制剂(CDK)结合而起到抑制细胞周期作用，同时也可与Cyclin复合物结合抑制其活性，控制细胞周期由G1期向S期的转变，在维持胃黏膜上皮细胞增殖及凋亡的平衡过程中起着重要作用，但其表达水平与Hp感染的关系叫较少报道[12]。

在p27、CyclinD1、MIF在不同组织中表达水平方面，胡桂梅等[13]的研究结果显示，p27在进展期胃癌组中表达水平明显低于慢性胃炎组及上皮肉瘤变组，与早期胃癌组对比无显著差异，且Hp感染阳性者p27表达阳性率下降，李多等[14]在分析胃癌组织中幽门螺旋杆菌感染与SOX2、CyclinD1蛋白表达的相关性时发现，在Hp感染阳性组胃癌组织中Cyclin D1蛋白表达水平达66.7%，明显高于Hp阴性组的28.5%，欧玉荣等[15]的研究结果显示胃癌组织中Hp-L阳性组MIF蛋白阳性表达率高于Hp-L阴性组，本研究结果显示Hp阳性组、Hp阴性组、正常黏膜组的p27、CyclinD1、MIF蛋白阳性表达率对比均有统计学意义，且Hp阳性组p27水平低于Hp阴性组、正常黏膜组，CyclinD1、MIF水平高于Hp阴性组、正常黏膜组，Hp阴性组、正常黏膜组上述指标对比也统计学意义，这与上述研究结果相似，因而在胃癌、胃癌合并Hp感染患者中p27呈低表达，CyclinD1、MIF则呈高表达，尤其对于合并Hp感染者，p27蛋白表达量进一步下降，而CyclinD1、MIF表达水平增加，p27、CyclinD1、MIF在胃癌发生发展中发挥重要角色。在与临床病理特征之间的关系方面，王军等[16]的研究结果显示，胃癌组织中Cyclin D1的表达水平与淋巴结转移有关，p27在胃癌组织中表达水平与组织学分级、浸润深度及淋巴结转移有关，本研究结果显示在胃癌患者中，临床分期Ⅲ-Ⅳ期、浸润深度见全层、分化程度高、淋巴结转移者p27、CyclinD1、MIF蛋白阳性高于临床分期Ⅰ-Ⅱ期、浸润深度未见全层、分化程度低、淋巴结未转移者，因此结合临床病理资料，有望将p27、CyclinD1、MIF蛋白表达作为评估胃癌生物学行为及预后的新指标。此外本研究结果也显示胃癌患者Hp感染与p27蛋白表达呈负相关，与CyclinD1、MIF蛋白表达水平存在正相关性，且p27与CyclinD1、MIF也呈负相关，这与胡桂梅、李多、欧玉荣等的研究结果也相近，因此p27、CyclinD1、MIF蛋白可作为临床诊断胃癌及是否合并Hp感染的辅助指标，为后期诊断及治疗、预后评估提供有价值信息。

综上所述，胃癌患者Hp感染与其p27、CyclinD1、MIF蛋白表达水平存在一定相关性，同时可用于评估预后，值得在临床推广应用。

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CorrelationbetweenHelicobacterpyloriinfectionandtheexpressionofp27，cyclinD1andMIFproteinsingastriccancer

CAOShi-tang1a，YIXiao-bing1b，WANGYu-hua2，YANGLi-yu1c

(1a.DepartmentofGastroenterology，1b.DepartmentofPathology，1c.MedicalAdministrationDivision，256ClinicalDepartment，BethuneInternationalPeaceHospital，Shijiazhuang050800，China；2.DepartmentofOncology，TheFourthAffiliatedHospitalofHebeiMedicalUniversity，Shijiazhuang050081，China)

ObjectiveTo analyze the correlation between Helicobacter pylori (Hp) infection and the protein expressions of cell cycle regulatory factor p27，cyclinD1 and macrophage migration inhibitory factor (MIF) in gastric cancer.MethodsSixty gastric cancer specimens confirmed by gastroscopy and pathology were collected between March 2012 and March 2017.According to the occurrence of Hp infection，they were divided into Hp positive or negative groups.Another 20 normal gastric mucosa tissues were collected as normal mucosa group.The expression levels of p27，cyclinD1 and MIF in the three groups were detected by immunohistochemistry，and their correlations with the clinicopathological features and Hp infection were analyzed.ResultsThe positive rate of p27 in the Hp positive group was lower than that in the Hp negative group and the normal mucosa group while the expression levels of cyclinD1 and MIF in the Hp positive group were higher than those in the Hp negative group and the normal mucosa group (P< 0.05).There were significant differences in above indexes between the Hp negative group and the normal mucosa group (P< 0.05).The expression levels of p27，cyclinD1 and MIF were related to clinical stage，depth of tumor invasion and tumor differentiation degree (P< 0.05).Correlation analysis also showed that Hp infection was negatively correlated with the expression level of p27，and positively correlated with the expression levels of cyclinD1 and MIF.There was a negative correlation between p27 and cyclinD1 and MIF levels (P< 0.05).ConclusionThere is correlation between Hp infection and the expression levels of p27，cyclinD1 and MIF proteins in gastric cancer tissues.P27，cyclinD1 and MIF may be involved in the development of gastric cancer.

Helicobacter pylori infection；Gastric cancer tissue；p27；CyclinD1；MIF；Correlation

R735.2

A

1672-6170(2017)05-0154-04

2017-03-21；

2017-05-23)