黄曲霉毒素B1对原代人皮肤成纤维细胞毒性作用研究

刘 珊，罗仲秋，谭 洪

(1.四川省医学科学院·四川省人民医院检验科，四川 成都 610072；2.成都中医药大学医学技术学院，四川 成都 610031；3.成都市第一人民医院普外科，四川 成都 610041)

黄曲霉毒素B1对原代人皮肤成纤维细胞毒性作用研究

刘 珊1，罗仲秋2，谭 洪3

(1.四川省医学科学院·四川省人民医院检验科，四川 成都 610072；2.成都中医药大学医学技术学院，四川 成都 610031；3.成都市第一人民医院普外科，四川 成都 610041)

目的探讨黄曲霉毒素B1(AFB1)对原代培养的人皮肤成纤维细胞(HSF)的毒性作用。方法分离培养原代HSF细胞，不同浓度的AFB1处理HSF细胞后，观察细胞形态学变化，并采用CCK-8法检测细胞存活率。结果AFB1能抑制HSF细胞生长，随着AFB1染毒浓度和染毒时间的增加，细胞增殖能力减弱。100 μmol/L和200 μmol/L的AFB1处理HSF细胞15天后，分别有62.4%和89.2%的细胞生长被抑制。结论AFB1对HSF细胞具有明显的细胞毒性作用。

黄曲霉毒素B1；原代人皮肤成纤维细胞；细胞毒性

黄曲霉毒素(aflatoxins，AF)是粮食食品霉变过程中主要由黄曲霉菌和寄生曲霉菌产生的剧毒代谢产物。其中，在天然污染的食品中以黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)最为多见，其毒性和致癌性也最强，对人类健康构成严重威胁[1～3]。目前，AFB1的强烈危害性已引起各国广泛关注，研究发现AFB1暴露能引起人体多个系统的毒性效应，包括消化系统毒性、肝脏毒性、生殖发育毒性等[4～7]。皮肤作为人体面积最大的组织器官，是人体接触外来物质的第一道屏障，也是最容易接触到AFB1的器官。但目前关于AFB1对皮肤毒性作用的研究，国内外尚未有报道。因此，2015～2017年作者分离培养健康人原代皮肤成纤维细胞(human skin fibroblast cells，HSF)，用AFB1处理HSF细胞后进行细胞增殖和毒性分析。为暴露于AFB1污染环境的人群提供一定的参考价值，并为AFB1对人皮肤细胞毒性作用的研究提供相关基础研究数据。

1 材料与方法

1.1主要仪器和试剂倒置显微镜(日本Olympus公司)、Model 680型酶标仪(美国Bio-Rad公司)。AFB1(纯度≥99%)(美国Sigma公司)、CCK-8试剂盒(日本Dojin公司)、二甲基亚砜(DMSO)(美国Sigma公司)，DMEM培养液(美国HyClone公司)、小牛血清(美国HyClone公司)，0.25%胰蛋白酶溶液(美国Thermo Fisher公司)、波形蛋白抗体(美国Labvision公司)、二抗免疫组织化学试剂盒(武汉晶美试剂公司)。

1.2原代HSF细胞的分离、培养、纯化和鉴定健康志愿者前臂皮肤经75%乙醇消毒后，取小块皮肤组织置于含3×105U/L青霉素、300 mg/L链霉素的PBS缓冲液中保存。迅速送往实验室后，在培养皿中，除去脂肪、结缔组织和皮下血管，放入含100 mU/ml dispase酶中4 ℃消化过夜。第二天，剥去表皮层，将真皮层剪成1 mm3大小的组织块，用0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA混合液37 ℃消化10 min，过100 μm筛网去除未消化组织块。分离得到的细胞加入细胞培养基(100 ml/L小牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素、2 mM L-谷氨酰胺和DMEM低糖培养基)，贴壁培养1 h，洗掉未贴壁细胞，加入细胞培养基，放入5% CO2、37 ℃培养箱中培养。通过差速贴壁法，进一步纯化细胞后，采用波形蛋白抗体鉴定皮肤成纤维细胞。

1.3实验分组和处理取对数生长期HSF细胞，按5×103/孔接种于96孔板，过夜培养14～18 h，使其充分贴壁。次日，将血清培养基替换为100 μl终浓度为100、200、300、400 μmol/L AFB1的培养基。溶剂对照孔中加入相应浓度的DMSO溶液。培养5、10、15天后，显微镜观察细胞形态，并采用CCK-8法检测细胞存活率。每个染毒组设置3个平行孔。

1.4CCK-8法检测细胞存活率AFB1染毒结束后，按照CCK-8试剂盒说明书检测细胞存活率。每孔加入10 μl CCK-8试剂，于细胞培养箱继续孵育4 h。使用酶标仪在检测波长450 nm、参比波长630 nm处分别测定每孔吸光度值，并计算细胞存活率。细胞存活率(%)=(样品A630 nm-样品A450 nm)/(对照A630 nm-对照A450 nm)×100

1.5统计学方法采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1细胞形态学观察AFB1染毒后，通过倒置显微镜观察发现细胞形态，对照组中HSF细胞形态正常，贴壁生长，呈长梭形，满视野生长，排列紧密。AFB1处理HSF细胞后，细胞形态无改变，贴壁生长，但细胞数量减少。随AFB1染毒浓度、染毒时间的增加，细胞数量越来越少。100 μmol/LAFB1处理15天后，细胞数量减少约40%；当AFB1浓度增加到200 μmol/L时，细胞数量仅有对照孔的10%(图1)。这表明随着AFB1染毒浓度和时间的增加，HSF细胞增殖活性越低。

图1 AFB1对HSF细胞生长抑制作用

2.2AFB1对HSF细胞毒性作用观察细胞形态变化后，进一步用CCK-8法对AFB1染毒后的细胞存活情况进行定量检测。100、200、300、400 μmol/LAFB1处理细胞5天后，100、200 μmol/LAFB1处理的细胞存活率和对照组相比，差异无统计学意义(P> 0.05)，但300、400 μmol/LAFB1处理的细胞存活率低于对照组(P< 0.05)。随着染毒时间的增加，细胞存活率越来越低。100 μmol/LAFB1染毒15天后，细胞存活率不到40%；当AFB1浓度增加到200 μmol/L时，细胞存活率仅有10.8%。见表1。

表1 CCK-8定量分析AFB1染毒后HSF细胞存活率 (%)

*与对照组比较，P< 0.05

3 讨论

AFB1具有极强的毒性和致癌性，广泛存在于各种粮食食品和饲料中，对人类健康构成了严重的威胁[8～11]。研究表明AFB1对肝脏、肾脏、消化系统、呼吸系统等都具有一定的毒性，能够造成相应细胞损伤[12～14]。然而，AFB1对皮肤的毒性作用鲜有报道，更是尚未有AFB1对原代分离培养的皮肤细胞毒性作用的报道。本实验采用原代皮肤成纤维细胞作为实验细胞株，研究AFB1对皮肤细胞的毒性作用。原代培养的细胞与体内原组织在形态结构和功能上相似性大，能更好地反应AFB1对人体皮肤的毒性效应。该研究可为暴露于AFB1污染环境的人群提供一定价值，以及为AFB1皮肤损伤作用的研究提供参考。

本研究发现，AFB1对HSF细胞具有明显的细胞毒性作用。随着AFB1染毒浓度和染毒时间的增加，细胞增殖活性减弱。已有多项研究报道了AFB1对多种其他体外培养细胞的毒性损伤作用。Ribeiro等研究发现AFB1对体外培养的肝细胞具有损伤作用，染毒剂量增加后，细胞大量凋亡而死亡[15]。Golli-Bennour等发现AFB1能使P53表达上调、Bcl-2表达下调，从而引起猴胚肾细胞核断裂、细胞死亡[7]。Lewis和Palanee等通过MTT法分别定量检测了AFB1对人食管上皮细胞和人非小细胞肺癌的毒性作用[16，17]。这些研究结果都表明AFB1通过引起细胞死亡对相应的体外培养细胞产生毒性效应。本研究发现，AFB1不引起HSF细胞死亡，而是通过引起HSF细胞生长抑制、增殖能力减弱产生毒性效应。这提示AFB1对人皮肤细胞产生损伤作用的机制可能不同，值得进一步研究。

[1] Yang XJ，Lu HY，Li ZY，et al.Cytochrome P450 2 A13 mediates aflatoxin B1-induced cytotoxicity and apoptosis in human bronchial epithelial cells[J].Toxicology，2012，300(3)：138-148.

[2] Storvik M，Huuskonen P，Kyllonen T，et al.Aflatoxin B1--a potential endocrine disruptor--up-regulates CYP19 A1 in JEG-3 cells[J].Toxicol Lett，2011，202(3)：161-167.

[3] Liu R，Jin Q，Huang J，et al.In vitro toxicity of aflatoxin B1 and its photodegradation products in HepG2 cells[J].J Appl Toxicol，2012，32(4)：276-281.

[4] Lei M，Zhang N，Qi D.In vitro investigation of individual and combined cytotoxic effects of aflatoxin B1 and other selected mycotoxins on the cell line porcine kidney 15[J].Exp Toxicol Pathol，2013，65(7-8)：1149-1157.

[5] Bernabucci U，Colavecchia L，Danieli PP，et al.Aflatoxin B1 and fumonisin B1 affect the oxidative status of bovine peripheral blood mononuclear cells[J].Toxicol In Vitro，2011，25(3)：684-691.

[6] He CH，Fan YH，Wang Y，et al.The individual and combined effects of deoxynivalenol and aflatoxin B(1)on primary hepatocytes of Cyprinus carpio[J].Int J Mol Sci，2010，11(10)：3760-3768.

[7] Golli-Bennour EE，Kouidhi B，Bouslimi A，et al.Cytotoxicity and genotoxicity induced by aflatoxin B1，ochratoxin A，and their combination in cultured Vero cells[J].J Biochem Mol Toxicol，2010，24(1)：42-50.

[8] Clarke R，Connolly L，Frizzell C，et al.High content analysis： a sensitive tool to detect and quantify the cytotoxic，synergistic and antagonistic effects of chemical contaminants in foods[J].Toxicol Lett，2015，233(3)：278-286.

[9] Qureshi H，Hamid SS，Ali SS，et al.Cytotoxic effects of aflatoxin B1 on human brain microvascular endothelial cells of the blood-brain barrier[J].Med Mycol，2015，53(4)：409-416.

[10]Zhang J，Zheng N，Liu J，et al.Aflatoxin B1 and aflatoxin M1 induced cytotoxicity and DNA damage in differentiated and undifferentiated Caco-2 cells[J].Food Chem Toxicol，2015，83：54-60.

[11]Forouharmehr A，Harkinezhad T，Qasemi-Panahi B.Effect of Aflatoxin B1 on Growth of Bovine Mammary Epithelial Cells in 3D and Monolayer Culture System[J].Adv Pharm Bull，2013，3(1)：143-146.

[12]Zimmermann CE，Cruz IB，Cadona FC，et al.Cytoprotective and genoprotective effects of beta-glucans against aflatoxin B(1)-induced DNA damage in broiler chicken lymphocytes[J].Toxicol In Vitro，2015，29(3)：538-543.

[13]Sun LH，Lei MY，Zhang NY，et al.Individual and combined cytotoxic effects of aflatoxin B1，zearalenone，deoxynivalenol and fumonisin B1 on BRL 3 A rat liver cells[J].Toxicon，2015，95：6-12.

[14]Clarke R，Connolly L，Frizzell C，et al.Cytotoxic assessment of the regulated，co-existing mycotoxins aflatoxin B1，fumonisin B1 and ochratoxin，in single，binary and tertiary mixtures[J].Toxicon，2014，90：70-81.

[15]Ribeiro DH，Ferreira FL，da Silva VN，et al.Effects of aflatoxin B(1) and fumonisin B(1) on the viability and induction of apoptosis in rat primary hepatocytes[J].Int J Mol Sci，2010，11(4)：1944-1955.

[16]Lewis CW，Smith JE，Anderson JG，et al.Increased cytotoxicity of food-borne mycotoxins toward human cell lines in vitro via enhanced cytochrome p450 expression using the MTT bioassay[J].Mycopathologia，1999，148(2)：97-102.

[17]Palanee T，Dutton MF，Chuturgoon AA.Cytotoxicity of aflatoxin B1 and its chemically synthesised epoxide derivative on the A549 human epithelioid lung cell line[J].Mycopathologia，2001，151(3)：155-159.

CytotocixityofaflatoxinsB1onprimaryhumanskinfibroblastcells

LIUShan1，LUOZhong-qiu2，TANHong3

(1.DepartmentofClinicalLaboratory，SichuanAcademyofMedicalSciences&SichuanProvincialPeople’sHospital，Chengdu610072，China；2.SchoolofMedicalScienceandTechnology，ChengduUniversityofTCM，Chengdu610031，China；3.DepartmentofGeneralSurgery，theFirstPeople’sHospitalofChengdu，Chengdu610041，China)

TANHong

ObjectiveTo investigate the cytotoxicity of aflatoxin B1(AFB1) on primary human skin fibroblast cells (HSF).MethodsPrimary HSF cells were isolated，cultured and treated with AFB1at different concentrations.The morphological changes were observed.Cell viability was measured by CCK-8 kit.ResultsAFB1could inhibit the growth of HSF cells.Cell viability was decreased with the increase of exposed dose and time.When HSF cells were treated with AFB1at concentrations of 100 μmol/L and 200 μmol/L for 15 d，62.4% and 89.2% of cell growth was inhibited，respectively.ConclusionAFB1exhibits significantly cytotoxic effects on HSF cells.

Aflatoxins B1；Primary human skin fibroblast cells；Cytotoxicity

谭 洪

R446.5

A

1672-6170(2017)05-0030-03

2017-02-06；

2017-04-24)