褐藻多糖硫酸酯、舒血宁注射液和丹红注射液对神经细胞保护的影响比较

张淑琴，欧阳存，宣 博，陈 茜，杨广笑，何光源，陈明洁

(1.江汉大学附属医院神经内科，湖北 武汉 430000；2.华中科技大学生命科学与技术学院，湖北 武汉 430000)

褐藻多糖硫酸酯、舒血宁注射液和丹红注射液对神经细胞保护的影响比较

张淑琴1，欧阳存1，宣 博2，陈 茜2，杨广笑2，何光源2，陈明洁2

(1.江汉大学附属医院神经内科，湖北 武汉 430000；2.华中科技大学生命科学与技术学院，湖北 武汉 430000)

目的探讨褐藻多糖硫酸酯、舒血宁注射液和丹红注射液对人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞增殖及缺糖缺氧保护的影响。方法在体外培养的SH-SY5Y 细胞中加入不同浓度的褐藻多糖硫酸酯、舒血宁注射液和丹红注射液，处理不同时间，采用MTT法检测细胞活性；对SH-SY5Y 细胞进行糖氧剥夺处理，加入不同浓度的三种药物处理细胞，分析三种药物对SH-SY5Y细胞增殖及缺氧缺糖导致的细胞损伤的影响；采用流式细胞术检测三种药物处理后细胞的周期变化。结果三种药物在一定浓度范围内促进细胞增殖。0.8 g/L褐藻多糖硫酸酯作用48 h后显著促进细胞增殖，细胞增殖率提高63.6%；对SH-SY5Y细胞的糖氧剥夺损伤有保护作用，细胞增殖率比对照提高13.5%；明显增加S期细胞比例，作用24 h由10.89%增加至18.18%。10%舒血宁注射液作用48 h后显著促进细胞增殖，细胞增殖率提高55.0%；对细胞糖氧剥夺损伤有保护作用，细胞增殖率比对照提高20.1%；对细胞周期无明显影响。5%丹红注射液作用48 h后显著促进细胞生长，细胞增殖率提高89.4%；明显增加S期细胞比例，作用72 h由15.05%增加至22.0%；但对细胞缺氧缺糖损伤无明显影响。结论一定浓度的褐藻多糖硫酸酯、舒血宁和丹红在体外均显著促进SH-SY5Y细胞的增殖，褐藻多糖硫酸酯和舒血宁降低缺氧缺糖导致的细胞损伤。三种药物均具有有效的神经细胞保护作用。

褐藻多糖硫酸酯，舒血宁，丹红，SH-SY5Y细胞，细胞增殖，细胞周期，糖氧剥夺，神经细胞保护

脑血管疾病(CVD)是神经系统的常见多发病，是目前导致人类死亡的三大主要疾病之一，并且存活者中有50%～70%的致残率，给社会和家庭带来沉重的负担[1]。而脑梗死(缺血性脑卒中)是CVD中最常见的类型，占全部CVD的70%，是一种急性起病的脑血液供应障碍疾病，由多种病理因素和危险因素参与，导致脑组织缺血、缺氧性坏死，出现相应的神经功能缺损[1，2]。对于如何提高急性脑梗死的疗效，降低死亡率及致残率，一直是目前的研究热点。本研究从神经细胞的保护性着手，观察褐藻多糖硫酸酯、舒血宁注射液和丹红注射液几种药物的神经保护影响。褐藻多糖硫酸酯是从褐藻中提取的一类硫酸化多糖，主要由岩藻糖和硫酸基组成，具有保护神经细胞、抗凝血、抗肿瘤、抗病毒、抗炎症、抗氧化、免疫调节等多种生物活性[2]。舒血宁注射液和丹红注射液是缺血性脑血管疾病的临床用药，其疗效得到一定的认可，褐藻多糖硫酸酯目前尚没有应用于临床。2012年6月至2016年2月作者以人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞为材料，通过体外细胞培养与增殖检测、细胞周期分析和缺氧缺糖损伤处理，比较褐藻多糖硫酸酯、舒血宁注射液和丹红注射液对人神经细胞增殖的影响以及对细胞缺氧缺糖损伤的保护作用。希望此研究对缺血性脑血管疾病的临床药物的开发、选择和使用具有一定的指导意义。

1 材料与方法

1.1材料褐藻多糖硫酸酯、胰蛋白酶、MTT以及DMSO均购自Sigma公司。丹红注射液由荷泽步长制药有限公司提供，舒血宁注射液由黑龙江珍宝岛药业股份有限公司提供。无支原体胎牛血清FBS购自杭州四季青公司，青霉素-链霉素溶液购自安特捷生物技术有限公司。PI检测试剂盒购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司，Na2S2O3购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2细胞培养SH-SY5Y细胞购自中国典型培养物中心(CTCC)，用含10%FBS和1%双抗(青霉素-链霉素溶液)的DMEM高糖培养基，37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。

1.3细胞增殖检测采用噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖。收集对数期细胞，接种至96孔板2×104个/孔，待细胞贴壁后，更换含有不同浓度药物的新鲜培养基，继续培养24、48或72 h后，每孔加入20 μl 5 g/L MTT溶液，孵育4 h后弃上清，每孔加入100 μl 二甲基亚砜(DMSO)，37 ℃暗培养15 min后，于490 nm测定光吸收值，以完全培养基为空白对照。细胞增殖率=(处理组吸光值/对照组吸光值)×100%。

1.4糖氧剥夺损伤处理应用氧糖剥夺诱导卒中样能量障碍是模拟体内缺血性损伤最普遍的方法[6]。收集对数期细胞计数，接种细胞至96孔板2×104/孔，待细胞贴壁，药物孵育24 h后，用2 mmol/L Na2S2O3的无糖Earle’s液处理，模拟神经细胞缺血时的缺氧缺糖状态，孵育1 h后，更换DMEM高糖培养基继续培养24 h后进行MTT检测。

1.5细胞周期分析采用PI染色法和流式细胞术。细胞培养至对数生长期，消化计数，接种至96孔板2×105个/孔，细胞贴壁后，更换含有各种药物的新鲜培养基，处理48 h后，收集细胞并用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，去上清，每个样品加入500 μl缓冲液重悬细胞，加入100 μl PI，混匀后室温避光孵育30 min。通过流式细胞仪检测，结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。

2 结果

2.1三种药物对SH-SY5Y细胞增殖的影响MTT检测结果表明，三种药物对SH-SY5Y细胞增殖均呈现浓度与时间相关性：0.6～2.0 g/L褐藻多糖硫酸酯促进细胞增殖，以0.8 g/L作用最为显著，作用48 h和72 h细胞增殖率提高分别为63.6%和150%；高浓度褐藻多糖硫酸酯(>2.0 g/L)作用24 h即呈现细胞增殖抑制，作用48 h时显著抑制细胞增殖，4 g/L抑制率达到40%。0.5～20%舒血宁注射液作用24 h无显著影响，作用48 h促进细胞增殖，以10%作用最为显著，作用48 h和72 h细胞增殖率提高分别为54.4%和57.5%。0.5%～10%丹红注射液作用24 h无显著影响，作用48 h促进细胞增殖，其中6%促增殖效果最为显著，作用48 h和72 h细胞增殖率提高分别为89.5%和98.0%。见图1。

图1 三种药物对SH-SY5Y细胞增殖的影响 a:褐藻多糖硫酸酯；b:舒血宁注射液；c:丹红注射液

2.2三种药物对SH-SY5Y细胞缺糖缺氧损伤的影响褐藻多糖硫酸酯和舒血宁注射液均有效降低缺氧缺糖对SH-SY5Y细胞的损伤，与对照组比较，0.8 g/L 褐藻多糖硫酸酯使细胞增殖率提高13.5%，10%舒血宁注射液使细胞增殖率提高20.1%，差异均有统计学意义(P< 0.001)。丹红注射液对细胞缺氧缺糖损伤没有明显影响。见图2。

图2 三种药物对SH-SY5Y细胞缺糖缺氧的影响

2.3三种药物对SH-SY5Y细胞周期的影响细胞周期分析结果表明，0.8 g/L 褐藻多糖硫酸酯和6%丹红注射液均明显提高S期细胞比例，表明褐藻多糖硫酸酯和丹红注射液促进SH-SY5Y细胞DNA合成，提高细胞分裂增殖效率。舒血宁注射液对细胞周期无明显影响。

表1 三种药物对SH-SY5Y细胞周期的影响 (%)

3 讨论

脑梗死的高发病率、高死亡率和高致残率对患者、家庭、社会都造成极大的负担，目前对于脑梗死的诊治方方面面都大力开展研究，其中，药物的神经保护也是一个很重要的方面。

褐藻多糖硫酸酯是从褐藻中提取的一类硫酸化多糖，研究发现其具有保护神经细胞、抗凝血、抗炎症、抗氧化、免疫调节等多种生物活性[3]，大鼠脑缺血再灌注损伤后使用褐藻多糖盐酸酯显示其通过提高转录因子NF-E2相关因子2(Nrf2)的表达缩小脑梗死体积，对脑缺血再灌注损伤大鼠起到神经保护作用[4]，目前均在实验阶段，尚未应用于临床。舒血宁注射液为银杏叶提取物，主要成分为总黄酮醇苷和银杏内酯，具有抗脂质和抗氧化自由基过氧化作用，扩张血管，改善循环，应用于心脑血管缺血性疾病[5，6]。丹红注射液主要由丹参和红花两种中药材经提取而成，其中主要的有效成分为丹参水溶性成分丹参酸、丹参酚酸及红花水溶性成分红花黄色素、红花酚苷和儿茶酚胺等，中医认为具有活血化瘀、通脉舒络等功效，现代医学研究认为具有很好的抗炎、降血脂、抗凝抑栓、抗凋亡、神经保护等作用[7，8]，临床广泛用于治疗高血压、冠心病、脑血栓、心绞痛等心脑血管疾病[9]，在计算机系统生物学研究中也显示丹红注射液参与抗炎、细胞分化与凋亡、心血管疾病、抗肿瘤等作用[10]，与临床治疗范畴相吻合。

SH-SY5Y细胞株作为拟神经细胞模型，广泛应用于神经系统疾病的发病机制和防止措施的研究[11]。本研究以SH-SY5Y细胞株为材料，通过神经细胞体外培养实验、细胞增殖检测、细胞周期分析和缺氧缺糖损伤处理，分别将褐藻多糖硫酸酯、舒血宁注射液和丹红注射液作用于神经细胞，比较三种药物对人神经细胞增殖的影响以及对细胞缺氧缺糖损伤的保护效果，以利于缺血性脑血管疾病的临床药物的开发、正确选择和有效使用。

本研究结果表明，三种药物在一定浓度范围内呈现浓度和时间依赖性地促进SH-SY5Y细胞增殖，作用48 h以6%丹红注射液效果最为显著，细胞增殖率比对照提高89.5%；作用72 h以8 g/L褐藻多糖硫酸酯增殖效果最佳，细胞增殖率比对照提高150%。褐藻多糖硫酸酯和舒血宁注射液均有效降低缺氧缺糖对SH-SY5Y细胞的损伤，舒血宁注射液效果尤佳。细胞周期分析结果表明，褐藻多糖硫酸酯和丹红注射液均通过提高S期细胞比例，加速细胞由S期通过G2期进入M期，提高细胞分裂效率以实现其促进神经细胞的增殖作用。

体外细胞实验结果表明三种药物具有一定的神经细胞保护作用，根据实验结果在临床用药中急性期48 h内使用丹红注射液，并且浓度控制在6%是否发挥临床疗效最佳。舒血宁对低氧低糖状态下疗效优于丹红，是否说明急性期之后舒血宁的疗效优于丹红注射液。作用72 h则以8 g/L褐藻多糖硫酸酯增殖效果最佳，并且对缺血低糖情况下能有效的保护神经细胞的损害，可以加速细胞由S期通过G2期进入M期，提高细胞分裂效率以促进神经细胞的增殖，但更高浓度的褐藻多糖硫酸酯则抑制细胞的增殖，从体外细胞实验可以展望褐藻多糖硫酸酯有着极好的前景。但作用的分子机制有待进一步研究。

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ComparisonofproliferativeeffectsofFucoidan，ShuxueninginjectionandDanhonginjectiononneuralcells

ZHANGShu-qing1，OUYANGCun1，XUANBo2，ZHENGQian2，YANGGuang-xiao2，HEGuang-yuan2，CHENMing-jie2

(1.DepartmentofNeurology，AffiliatedHospitalofJianghanUniversity，Wuhan430000，China；2.CollegeofLifeScienceandTechnology，HuazhongUniversityofScience&Technology，Wuhan430000，China)

CHENMing-jie

ObjectiveTo investigate the effect of Fucoidan，Shuxuening injection and Danhong injection on proliferation and protection of oxygen-glucose deprivation (OGD) of human SH-SY5Y neuroblastoma cells.MethodsSH-SY5Y cells were treated with different concentrations of Fucoidan，Shuxuening injection and Danhong injection for different time.Cell viability was determined by using MTT assay.SH-SY5Y cells were preconditioned for OGD.After treatment with the three types of drugs with different concentrations，cell viability was detected in order to analyze the effect of the drugs on cell proliferation and injure induced by OGD.Flow cytometry was used to analyze the cell cycle changes.ResultsThe three types of drugs at certain concentration increased the cell proliferation.0.8 g/L of Fucoidan treatment for 48 h，a 63.6% increase in the cell growth was observed.For protection of cell injury caused by OGD，the proliferation rate was increased by 13.5% and percentage of S phase was markedly increased from 10.89% to 18.18% after treatment for 24 h when compared to the controls.10% Shuxuening injection treatment for 48 h，a 55.5% increase in cell growth was found.For protection of cell injury caused by OGD，the proliferation rate was increased by 20.1% but no obvious effect on the cell cycle distribution was observed when compared to the controls.5% Danhong injection treatment for 48 h，a 89.4% increase in the cell growth and a significantly increase in the cell percentage of S phase from 15.05% to 22.0% after 72-hour treatment were observed，but no obvious effect on OGD injury was found.ConclusionFucoidan，Shuxuening injection and Danhong injection at certain concentration significantly increase the proliferation of SH-SY5Y cells.Fucoidan and Shuxuening injection could reduce the cell injury caused by OGD.The three types of drugs all have a protective effect on neural cells.

Fucoidan；Shuxuening injection；Danhong injection；SH-SY5Y cells；Cell proliferation；Cell cycle；OGD；Protective effect on neural cells

武汉市科技攻关计划资助项目(编号：201260523185)，武汉市卫计委基金资助项目(编号：WG16D02)

陈明洁

R741.05

A

1672-6170(2017)05-0037-04

2017-02-26；

2017-05-24)