PTEN基因在胶质瘤细胞SWO38及其亚系中表达的异质性研究

何利珍，钟雪云

(1.广州医科大学附属肿瘤医院，广东 广州 510095；2.暨南大学，广东 广州 510630)

PTEN基因在胶质瘤细胞SWO38及其亚系中表达的异质性研究

何利珍1，钟雪云2

(1.广州医科大学附属肿瘤医院，广东 广州 510095；2.暨南大学，广东 广州 510630)

目的比较人胶质瘤细胞SWO38及其克隆亚系SWOZ1和SWOZ2细胞株的PTEN(与张力蛋白同源在10号染色体有缺失的磷酸酶基因)基因表达的差异，探讨胶质瘤异质性的分子机制。方法应用RT-PCR技术、PCR-SSCP法及测序分析方法从定量和定性两方面比较PTEN基因在胶质瘤细胞SWO38及克隆亚系中表达的差异。结果PTEN基因在SWO38表达量最多，SWOZ2次之，SWOZ1表达量最少；三株细胞的PTEN基因未发现有基因突变，其序列长度、碱基组成及排列顺序完全相同，经BLAST比对后发现与数据库中4条序列完全匹配，4条序列均为野生型PTEN的mRNA序列。结论人胶质瘤细胞SWO38及 SWOZ1、SWOZ2中，PTEN基因在mRNA水平表达量明显不同，这些差异表达可能是决定两亚株细胞表现不同生物学行为的机制之一；三株细胞的PTEN基因均表现为野生型PTEN基因编码序列，提示可能是相同遗传背景的表现之一；SWOZ1和SWOZ2两株细胞可为进一步研究胶质瘤异质性分子机制提供良好的体外实验模型。

PTEN；胶质瘤；异质性；基因表达；BLAST

肿瘤的异质性是肿瘤细胞在宿主的选择压力下所展示的基因可变性或不稳定性，它几乎存在于肿瘤发育的所有水平，包括瘤间与瘤内异质性，瘤间异质性称为肿瘤之间的异质性，指同类肿瘤不同发病阶段、不同患者或相同患者不同肿瘤部位之间的基因型存在的差异[1]；而肿瘤内部不同区域，随着疾病的进展出现形态、功能差异的瘤细胞亚群，则称为肿瘤内部的异质性[2，3]。胶质瘤是人类常见的颅内肿瘤，世界卫生组织(WHO)将其分为4级，胶质母细胞瘤(glioblastomamultiforme，GBM)是其中最常见的、恶性度最高、侵袭性最强的成人脑肿瘤[4]。最近大规模基因组分析研究明确GBM是一组异质性肿瘤，具有各自独特的分子和遗传特征，美国癌症基因组图谱(TCGA)计划研究小组根据GBM基因表达水平将其分为四类分子亚型：前神经元型，神经元型，经典型和间叶型[5]。目前的研究已发现，PTEN基因异常可存在于多种肿瘤，被认为是继p53和Rb基因后，又一种改变较广泛、与肿瘤发生关系密切的抑癌基因。本研究拟在基因水平从定量和定性两方面比较PTEN基因在人脑胶质瘤细胞SWO38及其克隆亚系中表达的差异，探讨胶质瘤异质性的分子机制。

1 材料与方法

1.1材料人胶质瘤细胞株SWO38[6]及其克隆亚系SWOZ1和SWOZ2[7]由暨南大学医学院病理教研室提供，外周血单个核细胞自备。TRIzol试剂购自Invitrogen公司；RT-PCR试剂盒购自TaKaRa公司；其余试剂均为进口分装或国产分析纯。

1.2方法

1.2.1细胞培养 人胶质瘤细胞株SWO38及两克隆亚系SWOZ1、SWOZ2用含10%新生牛血清的RPMI-1640培养液，置37 ℃含5%CO2湿化培养箱内常规培养。

1.2.2提取细胞 总RNA 取相同条件下对数生长期的SWO38、SWOZ1、SWOZ2细胞，同时用密度梯度离心法分离正常人外周血的单个核细胞。将获得的四种细胞用PBS洗涤二次，加入TRIzol试剂(1 ml TRIzol/cm102细胞)裂解后，加入氯仿(每毫升TRIzol加0.2 ml氯仿)进行相分离，转移上层RNA水相于新EP管内，经异丙醇沉淀离心后，收集提取的细胞总RNA。紫外分光光度计测定RNA的纯度和浓度，保存于-70 ℃备用。

1.2.3PCR引物设计与合成 PTEN引物序列查自NCBI(美国国立生物技术信息中心)的Nucleotide数据库，并采用Primer Premier 5.0软件设计PCR引物，扩增PTEN基因编码序列的引物：上游-5'ATGACAGCCATCATCAAA3'，下游-5'TCAGACTTTTGTAATTTGTG3'，分片段扩增PTEN基因编码序列的引物：A片段：上游-5'ATGACAGCCATCATCAAAG3'，下游-5'GCCTCTTGTGCCTTTAAA3'，B片段： 上游-5'ATGTGCATATTTATTACATCG3'，下游-5'TTCCTCTGGTCCTGGTAT3'，C片段：上游-5'CAAAGTAGAGTTCTTCCACA3'，下游-5'TCAGACTTTTGTAATTTGTGT3'，所有引物序列均由广州赛百盛公司合成。

1.2.4RT-PCR反应 从各细胞中提取的总RNA分别以1 μg等模板量进行RT-PCR扩增，50 μl反应体系含总RNA 1 μl(RNA浓度1 μg/ μl)，20 μmol/L上游与下游引物各1 μl，余反应物同试剂盒要求，应用β-actin基因保守序列为内标性对照。先行反转录反应，反转录条件：一个循环，50 ℃延伸25 min，99 ℃灭活反转录酶5 min；然后行PCR扩增，扩增条件：①扩增PTEN基因编码序列全长及β-actin：先94 ℃变性2 min，然后进行35循环，每个循环包括94 ℃1 min、60 ℃1 min、72 ℃ 20 min，最后72 ℃延伸5 min。②分片段扩增PTEN基因编码序列：先94 ℃变性2 min，然后进行35循环，每个循环包括94 ℃30秒、51 ℃(A、C片段)或50 ℃(B片段) 30秒、72 ℃1 min，最后72 ℃延伸5 min。反应结束后，取PCR反应液5 μl进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶图象分析系统测定PTEN基因电泳条带的光密度、积分值。

1.2.5SSCP检测 将RT-PCR扩增后的DNA样品(PTEN基因的A、B、C片段)各取4 μl与4 μl变性Loading Buffer混合，95 ℃变性5 min，然后立即置于冰浴中5 min，将8 μl上样于6%非变性聚丙烯酰胺凝胶，1×TBE为缓冲液，先以300 V电泳5 min，待样品进入凝胶后，在电压230 V下电泳6 h。银染后观察SSCP电泳条带，如果凝胶中胶质瘤细胞出现与正常人外周血细胞不同的异常移动电泳带则说明存在突变，即SSCP阳性。

1.2.6测序及序列分析 分别使用A片段下游引物、B片段下游引物和C片段上游引物，由北京博亚公司测序，并将测序后结果进行拼接，形成完整的PTEN基因序列，将拼接完整的PTEN基因序列提交BLAST数据库进行查询比对并分析。

2 结果

2.1RT-PCR检测结果

2.1.1电泳结果 PTEN基因在正常人外周血细胞和胶质瘤细胞SWO38、 SWOZ1及SWOZ2中均有表达，SWO38中表达量最多，SWOZ2次之，SWOZ1表达量最少，此实验重复3次结果均相同。β-actin为内参照(图1)(注：从各细胞中提取的总RNA分别以1 μg等模板量进行RT-PCR扩增，终产物各取5 μl电泳)。

图1 外周血细胞和SWO38、 SWOZ1、SWOZ2细胞中PTEN基因RT-PCR扩增产物电泳图

2.1.2扫描结果 在凝胶中可清楚看到SWO38在PTEN基因处的峰值明显高于SWOZ1和SWOZ2，SWOZ1的峰值最小，见图2。三株细胞中，母系SWO38的PTEN基因电泳条带吸光度值和积分值均明显大于两亚系的值，并且，两亚系SWOZ1和SWOZ2的PTEN基因电泳条带吸光度值和积分值之和接近于母系SWO38的PTEN基因电泳条带吸光度值和积分值，见表1。

图2 SWO38和SWOZ1、SWOZ2细胞中PTEN基因处电泳条带纵向扫描分析比较图

组别峰值积分值SWOZ11363SWOZ221108SWO3831174

2.2SSCP检测结果在胶质瘤细胞SWO38及 SWOZ1、SWOZ2中扩增得到PTEN基因的A、B、C片段，PAGE电泳后经过染色，在凝胶上可以见到清楚的2条带，此2条带是DNA解链分开后的2条单链形成的。与正常对照相比，两条单链形成的条带相对位置没有变化，说明三株细胞均无突变发生，见图3。

图3 SSCP电泳结果 a：A片段；b：B片段；c：C片段 (N：正常人外周血细胞，1：SWOZ1，2：SWOZ2，3：SWO38)

2.3测序结果及序列分析胶质瘤细胞SWO38及 SWOZ1、SWOZ2中扩增的PTEN基因编码序列全长均为1212 bp(含终止密码)，三者的碱基组成及排列顺序亦完全相同，此序列经BLAST比对后发现与数据库中4条序列完全匹配，同一性达100%，其相似性分数值(S)最大：Score = 2403 bits (1212)，期望值(E)最小：Expect = 0.0。这4条序列虽然名称不同，长度不一，实际均为野生型PTEN的mRNA序列，含有完整的1212 bp的编码区序列。

3 讨论

PTEN 位于染色体10q23.3，基因全长210 kb，由9个外显子和8个内含子组成，mRNA长度为5.5 kb，PTEN蛋白是一条由1209个核苷酸编码403个氨基酸组成的多肽链[8]。PTEN作为第一个属于磷酸酶家族的抑癌基因，通过激活PI3K(phosphatidylinositol 3-kinase)信号传导通路发挥调控作用，编码的蛋白质在细胞胞质内表现出特异的脂质磷酸酶和蛋白磷酸酶双重活性，参与调控肿瘤细胞的增殖和分化、凋亡、细胞骨架建立和细胞周期阻滞、侵袭和转移等多种效应[9]。

有关胶质瘤的分子标志物有很多种，PTEN仅是其中之一。刘金戈等[10]对人胶质瘤的研究中发现PTEN的表达水平在不同级别胶质瘤中差异显著(P< 0.05)，与胶质瘤的恶性程度呈负相关。侯桂琴等[11]通过RT-PCR和基因测序技术检测食管鳞癌细胞株中PTEN mRNA 的表达水平及PTEN突变情况，发现高分化食管癌细胞株Eca109中PTEN mRNA的表达水平高于低分化食管癌细胞株EC9706和Eca109的PTEN mRNA表达，3株细胞中均有不同程度的PTEN基因突变，其中5和8外显子突变明显。早前研究发现，大约50%的GMB中同时存在表皮生长因子受体EGFR基因的扩增和突变，扩增表现为正常的EGFR表达水平上升，而突变则产生不依赖于配体的变异型EGFR，又称EGFRvIII，具有独立促进胶质瘤发生发展的能力，既能促进肿瘤细胞的增殖，又具有对细胞的损失进行修复的功能[12]。还有人端粒逆转录酶(hTERT)，大约70%～80%原发型GBM和70%的少突胶质细胞瘤具有hTERT启动子的突变，hTERT启动子的突变是胶质瘤发生发展的早期事件[13]，增强了端粒酶的表达水平和端粒酶的活性，TRET的表达水平与患者的生存期成负相关，与胶质瘤的恶性程度成正相关[14]。

本研究利用RT-PCR法检测了人胶质瘤细胞SWO38及其亚系SWOZ1和SWOZ2中的PTEN 基因表达情况，研究结果显示此三株细胞PTEN基因表达量各不相同；用SSCP方法检测没有发现基因突变，考虑有可能是DNA链中突变部位未能对单链立体构象造成影响，形成假阴性结果；进一步测序分析发现三株细胞的PTEN基因碱基组成及排列顺序完全相同，BLAST比对分析显示为野生型PTEN编码序列。在胶质瘤细胞SWO38及 SWOZ1、SWOZ2中，PTEN的mRNA表达定性检测未发现有突变，定量检测发现，SWO38表达量最多，SWOZ2次之，SWOZ1表达量最少。其中，SWOZ1和SWOZ2两株细胞亚系是2000年从SWO38胶质瘤细胞系中分离培养出来，两者恶性程度差别明显，高低分化显著不同，具有典型肿瘤异质性的特点[15]。本实验室前期工作中于莉娜等[16]论证了SWOZ1和SWOZ2两株细胞亚系存在蛋白质水平的异质性。本研究以PTEN为靶点比较人胶质瘤细胞SWO38及其克隆亚系SWOZ1和SWOZ2在核酸分子水平表达的差异，结合测序结果分析，SWOZ1和SWOZ2两株细胞之间既有同源性，又同时存在有异质性。

总之，PTEN基因功能状态和基因变异方式与胶质瘤的发生发展等生物学行为密切相关，深入研究此三株细胞的背景情况，为其将来在肿瘤增殖、分化、转移机理等方面作为研究模型奠定良好的理论基础，尤其是SWOZ1和SWOZ2两株细胞，既有同源性，又同时存在有异质性，可为进一步研究胶质瘤异质性分子机制提供良好的体外实验模型。

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TheheterogeneityofPTENgeneexpressioninhumangliomacelllineSWO38anditstwosublines

HELi-zhen1，ZHONGXue-yun2

(1.AffiliatedCancerHospital，GuangzhouMedicalUniversity，Guangzhou510095，China；2.JinanUniversity，Guangzhou510630，China)

ObjectiveTo compare the differences in expression of PTEN gene，that is homologous to tension protein phosphatase gene and missing on the 10thchromosome，in human glioma cell line SWO38 and its two sublines SWOZ1 and SWOZ2 in order to explore the molecular mechanism of tumor heterogeneity of human glioma.MethodsThe differences in quantitative and qualitative PTEN expression in the cell lines were examined by using RT-PCR technique，PCR-SSCP technique and sequence method.ResultsThe levels of PTEN gene expression in the line SWO38 were highest followed by SWOZ2 and SWOZ1 was the lowest.There was no mutation in PTEN gene in the three cell lines.The sequences of PTEN gene in the three cell lines were the same in length，nucleotide constitution and alignment that completely matched with four sequences existed in the international nucleotide database by BLAST，that were mRNA sequence of wild-type PTEN.ConclusionThere is a definite difference in expression of PTEN mRNA in the three cell lines.It suggests that these different gene expressions relate to the different biological characters of those two sublines.The PTEN gene in the three cell lines held the wild-type PTEN and held one of the aspects of identical hereditary background.The SWOZ1 and SWOZ2 are patent as an ideal model in study of the molecular mechanism of the heterogeneity in glioma.

PTEN；Glioma；Heterogeneity；Gene expression；BLAST

R739.4

A

1672-6170(2017)05-0027-04

2017-03-12；

2017-05-23)