MMP-7在胃癌中表达上调的临床病理意义及预后价值

沈小钢，郭志义，赵高平，王 林

(四川省医学科学院·四川省人民医院胃肠外科，四川 成都 610072)

MMP-7在胃癌中表达上调的临床病理意义及预后价值

沈小钢，郭志义，赵高平，王 林

(四川省医学科学院·四川省人民医院胃肠外科，四川 成都 610072)

目的探讨基质金属蛋白酶-7(MMP-7)的表达与胃癌临床病理特征的关系以及对胃癌患者预后判断的价值。方法采用实时荧光定量PCR技术检测112例胃癌患者的癌组织和癌旁正常组织中MMP-7的表达。比较不同MMP-7表达水平胃癌患者的临床病理学特征，以及患者的生存分析。结果MMP-7在胃癌组织中相对于正常胃黏膜组织高表达(P= 0.001)。胃癌患者MMP-7表达上调，有更高的病理学分期(P= 0.037)，更深的组织浸润深度(P= 0.028)，淋巴结转移(P= 0.015)和脉管浸润(P= 0.042)，以及更差的总体生存率(P= 0.008)和无病生存率(P= 0.015)。结论MMP-7在胃癌患者中高表达并预示着更差的术后生存率。

基质金属蛋白酶-7；胃癌；转移；预后

全球每年新发胃癌951600例并导致723100例死亡[1]。尽管手术技术不断提高化疗药物不断发展，我国胃癌患者的五年生存率依然低于40%。基因的易感性以及环境因素共同导致了肿瘤的发生已获得了广泛的共识。研究胃癌的侵袭和转移对早期诊断胃癌，提高胃癌患者的预后具有重要意义。基质金属蛋白酶(MMPs)是一类分泌蛋白水解酶，该蛋白酶能降解细胞外基质，对血管生成、组织修复以及肿瘤浸润都有十分重要的作用[2]。基质金属蛋白酶-7(MMP-7)又称基质溶素，已有研究发现MMP-7蛋白在胃癌中高表达[3]。但目前对胃癌中MMP-7的mRNA表达水平知之甚少，更是缺乏其表达与胃癌患者预后关系的研究。本研究拟通过实时荧光定量PCR技术，研究MMP-7在胃癌及癌旁正常组织中的表达变化，分析不同表达水平胃癌患者的临床病理学特征，以及不同的生存率，为胃癌的临床诊断及治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1一般资料2011年7～12月在四川省人民医院胃肠外科中心行胃癌根治术的患者112例，术前未接受放疗或化疗，术后给予常规化疗。癌旁正常组织取材于距离肿瘤边缘至少5厘米的胃正常黏膜组织。所有胃癌及胃正常黏膜组织均在标本离体后第一时间采集并立即存放于液氮罐，最终存放于-80 ℃冰箱。术后依据国际抗癌联盟第7版TNM分期对病员进行病理分期。患者的随访在术后的前两年每3个月1次，之后每半年1次，包含体格检查，肿瘤标志物检查，CT和胃镜检查。怀疑复发则通过活检进一步诊断。总生存期定义为手术日至患者死亡的时间，无病生存期定义为手术日至癌症复发或患者死亡的时间。该研究符合四川省医学科学院·四川省人民医院医学伦理委员会所制定的伦理学标准并通过该委员会批准，所有受试对象术前均签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1引物序列与合成 本实验选取GADPH作为内参基因，利用Taqman Gene Expression Assays软件设计针对MMP-7和GADPH的特异性引物和探针由中国大连的Takara生物公司合成，如表1所示，并通过NCBI提供的BLAST程序验证了核酸序列的特异性。

表1 MMP-7与GADPH的引物及探针序列

1.2.2荧光定量PCR检测 使用美国Invitrogen公司的Trizol试剂按照说明书的方法提取总RNA，用紫外分光光度计测量260和280 nm下的吸光度并进行定量，计算D(260)/D(280)，所有标本的比值要求在1.8～2.0之间。低于此值者表明其含有杂质，用氯仿重新提纯。利用美国Fermentas公司的第一链合成试剂盒将2μg的RNA逆转录生成cDNA。基于Taqman探针技术的实时荧光定量PCR技术被用于基因表达的相对定量检测。该实验在美国BIO-RAD公司的iCycler iQ系统上完成。所用的反应条件如下：预变性温度 94 ℃：2分钟，解链温度94 ℃ ：20秒，退火温度53 ℃：30秒，复性温度72 ℃：30秒。共经过50个循环。扩增结束后，每一个标本都会得到一个Ct值，它是荧光信号超过阈值所需的循环数。PCR扩增效率采用公式E=10-1/slope计算。MMP-7的相对表达率R的计算基于PCR扩增效率E以及样本和对照的差(ΔCt)。R = (EMMP-7)ΔCtMMP-7 (control-sample)/(Eβ-actin)ΔCtβ-actin (control-sample)。R>1时表明MMP-7在胃癌(样本组)中相对于胃正常黏膜组织(对照组)高表达。

1.3统计学方法采用基于随机化检测的统计学分析软件REST(relative expression software tool)对MMP-7在胃癌及胃正常组织的表达变化进行检测[4]。SPSS 16.0软件基于卡方检验对MMP-7表达变化与胃癌临床病理学指标的差异进行统计分析。基于对数秩检验的Kaplan-Meier法进行生存分析。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1MMP-7在胃癌和胃正常黏膜的表达变化MMP-7 mRNA在所有标本中均能被检测，RT-PCR扩增产物为设计长度(MMP-7，122bp；GADPH，141bp)。在50个扩增循环中未发现引物二聚体。将5个等比例浓度梯度的cDNA进行扩增后得到的Ct值输入REST软件则获得本反应体系下PCR扩增效率。在本实验中MMP-7和GADPH的PCR扩增效率分别为1.88和1.72。在所有的112份配对的样本中，86例R>1，这表明MMP-7在这些患者的癌组织中相对于正常黏膜组织高表达。如表2所示，MMP-7在胃癌的表达强度是其在胃正常黏膜中表达强度的4.382倍(P= 0.001)。

表2 REST软件对胃癌和胃正常黏膜中MMP-7表达变化的输出结果

2.2MMP-7不同表达水平下胃癌临床病理特征的比较如表3所示，在MMP-7表达上调和表达下调中，胃癌的TNM分期、浸润深度、淋巴结转移、脉管浸润比较差异有统计学意义(P< 0.05)，而性别、年龄、肿瘤大小及分化程度比较，差异无统计学意义(P> 0.05)。

表3 MMP-7不同表达水平胃癌临床病理学特征的比较

2.3不同MMP-7表达水平胃癌患者的生存分析

无论是总生存率(P= 0.008)还是无病生存率(P= 0.015)，MMP-7表达上调的胃癌患者均较其表达下调的患者差。胃癌的中位生存时间及五年生存率在MMP-7表达上调和下调的患者中分别是26个月和40.7%以及66个月和69.2%。

图1 不同MMP-7表达水平胃癌患者的生存曲线

图2 不同MMP-7表达水平胃癌患者的无病生存率

3 讨论

癌症转移的机制至今尚未完全阐明，是一个多步骤、多阶段的复杂过程。一般认为癌细胞需穿过细胞外基质以及脉管基底膜进入循环系统从而发生全身转移。其中对细胞外基质和脉管基底膜的降解是其必要条件。MMPs已被证明可以降解细胞外基质和脉管基底膜，能够促进肿瘤新生血管的形成，与肿瘤的浸润、转移密切相关[5]。1988年被首次报道的MMP-7基因位于11号染色体，包含有267个氨基酸，因其缺乏碳末端蛋白结构域是MMPs家族中最小的成员[6]。MMP-7在众多肿瘤组织中过表达，被认为在细胞增殖、凋亡、浸润、转移以及血管生成等多个环节参与了肿瘤的发展。

本研究通过实时荧光定量PCR技术检测在112例配对的胃癌组织及癌旁正常黏膜组织中MMP-7的表达变化，进一步证实在mRNA水平，相对于正常胃黏膜，MMP-7在胃癌中高表达。MMP-7表达上调的胃癌患者中，TNM分期更晚，肿瘤浸润深度更深，更易出现淋巴结转移和脉管浸润。由此可知MMP-7随胃癌的发展而表达逐渐增高。有淋巴结转移的胃癌患者MMP-7表达上调的概率更高，这与既往的报道一致[7]。这表明MMP-7表达与肿瘤的转移相关，而肿瘤的转移与肿瘤患者的预后密切相关，同时本研究通过生存分析直接观察到MMP-7表达上调的患者寿命更短，肿瘤也更容易复发转移。前期已有报道表明在喉癌、结直肠癌及食管癌患者中，MMP-7表达高则意味着更差的预后[8～10]。是否在更多的肿瘤中MMP-7也具有相同的判断预后能力，则需要进一步的研究。

该研究采用实时荧光定量PCR技术发现MMP-7在胃癌组织中的表达显著高于胃正常黏膜组织，且MMP-7不同表达水平的胃癌患者病理分期、肿瘤浸润深度、有无淋巴结转移和脉管浸润是有差异的，表明MMP-7在胃癌的发生、发展及转移中发挥了重要的作用。而MMP-7高表达的胃癌患者有着更差的预后则表明该基因有望成为判断胃癌患者预后的生物标志物。能否通过RNA干扰技术下调MMP-7表达来治疗胃癌，需要下一步研究和实验证明。

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ClinicopathologicalandprognosticsignificanceofupregulatedMMP-7ingastriccancer

SHENXiao-gang，GUOZhi-yi，ZHAOGao-ping，WANGLin

(DepartmentofGastrointestinalSurgery，SichuanAcademyofMedicalSciences&SichuanProvincialPeople’sHospital，Chengdu610072，China)

ObjectiveTo evaluate the clinicopathological significance of MMP-7 expression and investigate its prognostic value in gastric cancer.MethodsMMP-7 mRNA expression in cancerous tissue and corresponding normal mucosa tissue from 112 gastric cancer patients were analyzed by quantitative real-time RT-PCR.The clinicopathological characteristics and survival rates were compared among patients with various expression levels.ResultsThe expression of MMP-7 mRNA was found to be upregulated in cancerous tissue compared to normal mucosa tissue (P= 0.001).The expression levels were associated with advanced TNM stage (P= 0.037)，enhanced penetration depth (P= 0.028)，lymph node metastasis (P= 0.015) and vessel invasion (P= 0.042).Patients with upregulated MMP-7 showed a worse overall survival (P= 0.008) and disease free survival (P= 0.015).ConclusionThe expression of MMP-7 is upregultaed in cancer and associated with a decreased survival rate in patients with gastric cancer.

MMP-7；Gastric cancer；Metastasis；Prognosis

R735.2

A

1672-6170(2017)05-0128-04

2017-02-18；

2017-05-22)