急性白血病治疗前后外周血单个核细胞T细胞免疫球蛋白黏蛋白3的表达水平及意义

伍香玲

(川北医学院微生物学与免疫学教研室，四川 南充 637007)

急性白血病治疗前后外周血单个核细胞T细胞免疫球蛋白黏蛋白3的表达水平及意义

伍香玲

(川北医学院微生物学与免疫学教研室，四川 南充 637007)

目的探讨急性白血病治疗前后外周血单个核细胞T细胞免疫球蛋白黏蛋白3(Tim-3)的表达水平及意义。方法选取2015年2月至2017年3月我院收治的25例急性白血病患者(研究组)及同期我院体检的25例健康志愿者及其供体的骨髓(健康组)，将单个核细胞分离后提取DNA，受试患者接受标准方案化疗治疗，采用实时荧光定量聚合酶链反应检测单个核细胞上Tim-3 mRNA表达量。结果研究组治疗前外周血T细胞Tim-3比率及Tim-3 mRNA相对表达量明显高于健康组及治疗后(P< 0.05)；而研究组治疗后外周血T细胞Tim-3比率及Tim-3 mRNA相对表达量与健康组差异无统计学意义(P> 0.05)；急性白血病患者临床疗效与Tim-3基因表达量呈明显负相关(P< 0.05)。结论Tim-3基因在急性白血病初治患者中存在明显高表达现象，其表达水平高低在急性白血病患者治疗效果的评估中有一定积极作用。

急性白血病；治疗；Tim-3；临床意义

急性白血病为临床常见血液系统恶性肿瘤，是一种起源于造血干细胞的克隆性恶性血液病，其疾病发生及进展与机体免疫功能紊乱紧密相关[1]。目前临床对其发病机制尚未完全明确，普遍认为本病是多种因素共同作用的结果；既往研究指出T淋巴细胞和自然杀伤细胞是机体细胞免疫的重要组成部分，在预防肿瘤中发挥重要作用[2]。而Tim-3是近年来才被关注的重要负性共刺激分子，属于Tim基因家族成员之一，有研究指出Tim-3及其配体参与了初发系统性红斑狼疮患者的细胞免疫调节，与疾病活动性存在明显相关性[3]，另一研究指出Tim-3及其配体可通过负调控Th1细胞功能，推出Tim-3广泛参与特异性免疫应答的调节中，因而临床可考虑Tim-3在评估急性白血病患者诊治中可能具有一定应用价值[4]。为此笔者对急性白血病治疗前后外周血Tim-3表达水平变化及其临床意义进行探究，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料选取2015年2月至2017年3月我院收治的25例初发急性白血病患者(研究组)，男13例，女12例，年龄16～70岁[(46.25±10.32)岁]，体重32～50 kg[(42.57±5.27)kg]。纳入标准：①符合《血液病诊断及疗效标准》[5]有关急性白血病诊断标准；②初次确诊为急性白血病；③未合并其它血液性疾病；④符合赫尔辛基宣言，自愿签署相关知情同意书。排除标准：①妊娠期及哺乳期妇女；②既往有急性白血病史；③合并严重心、肝、肾等重要脏器功能障碍；④纳入研究前经过药物治疗；⑤对本研究依从性不高者。选取同期我院体检的25例健康志愿者(健康组)，男14例，女11例，年龄18～70岁[(45.98±10.01)岁]，体重30～48 kg[(41.97±5.07)kg]。两组基线资料比较差异无统计学意义(P> 0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1治疗方案 受试患者均行DA、MA等标准化疗方案治疗，最终有23例患者达到完全缓解，2例自动出院失访。

1.2.2检测方法 ①主要试剂及仪器：由天津瀚洋生物制品科技有限责任公司提供的淋巴细胞分离液，Trans Gen生物科技公司提供RNA抽提试剂Trizol和SuperMix cDNA反转录试剂盒，由美国R&D公司提供的人鼠抗人TIM-3抗体，美国AB公司提供SYBR Green聚合酶链反应Master Mix试剂盒，选用GE医疗集团提供的GeneQuan 1300/100紫外分光光度计，PCR仪及分析软件由美国AB公司提供，美国BD公司提供给FACS Calibur流式细胞仪。②检测步骤：选取纳入研究对象外周静脉血适量，选用乙二胺四乙酸抗凝，分别加入小鼠抗人单克隆抗体(藻红蛋白-Cy5-CD3)、异硫氰酸荧光素(FITC)-CD4、藻红蛋白-TIM-3，避光标记20 min，待红细胞裂解液孵育7 min后，注意避免振荡；此外每管加入磷酸盐缓冲液1 ml洗涤2次后，上机待检，最后采用流式细胞仪检测受试对象外周血中Tim-3表达情况，同时采用Flowjo软件对所得数据进行分析处理。③RNA提取及cDNA合成：取研究对象骨髓标本，采用Ficoll密度梯度法将骨髓单个核细胞分离，参照美国Invitrogen公司提供的TRIzol法提取总的RNA，经1.5%琼脂糖凝胶电泳以确定RNA是否完整，采用紫外分光光度仪测定其吸光度(A)260/A280>1.8，并计算其RNA含量，采用100 ng六随机引物、200U M-MLV 酶反转录为cDNA。④Tim-3基因检测：采用SYBR Green I染料在ABI荧光定量PCR仪上检测Tim-3基因的表达，PCR采用2步法进行，反应条件设定为95 ℃，10 min预变性；95 ℃ 15 s，60 ℃ 退火延伸1 min，共循环40个，待反应完毕后将扩增每份PCR产物采用溶解曲线分析，并判断是否为特异性产物，每个样本的Tim-3及β-action mRNA的检测均行3个平行管以确保结果的准确性，最终取平均值，而目的基因相对表达水平采用2-△Ct计算，即△Ct=Ct目的基因-Ct内参基因。

1.3观察指标①治疗前后研究组与健康组外周T细胞Tim-3表达比较。②Tim-3基因PCR溶解产物特异性分析。③Tim-3基因在健康组及治疗前后研究组骨髓中的表达。④急性白血病治疗后的疗效与Tim-3基因表达量的相关性分析。

1.4统计学方法采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析和处理。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t检验；计数资料比较采用χ2检验；相关分析采用Sperman相关性分析。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1两组外周血T细胞Tim-3表达比较研究组治疗前外周血T细胞Tim-3表达高于治疗后和健康组(P< 0.05)，研究组治疗后外周血T细胞Tim-3表达与健康组比较差异无统计学意义(P> 0.05)，见表1。

表1 两组外周血T细胞Tim-3表达比较

﹡与研究组治疗前比较，P< 0.05

2.2Tim-3基因PCR溶解产物特异性分析溶解曲线显示Tim-3基因和β-actin的PCR产物都呈较锐单峰，且溶解曲线中无其它杂峰，表明扩增产物具有特异性，无引物二聚体和非特异性产物；而随机抽取的标本的RT-q PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，而最终结果显示都呈单一条带，并且目的基因Tim-3与内参基因β-actin的PCR产物分别位于75 pb及188 bp处，且无杂带，进一步表明反应的特异性，见图1。

图1 实时荧光定量聚合酶链反应检测急性白血病患者Tim-3基因表达 M：marker；a～d：急性白血病患者；e～f：健康者

2.3两组骨髓中T细胞Tim-3mRNA表达比较研究组治疗前Tim-3 mRNA相对表达量高于治疗后和健康组(P< 0.05)；研究组治疗后Tim-3 mRNA相对表达量与健康组比较差异无统计学意义(P> 0.05)，见表2。

表2 两组骨髓中T细胞Tim-3 mRNA表达比较

2.4急性白血病治疗后的疗效与Tim-3基因表达量的相关性分析Sperman相关性分析显示，急性白血病患者临床疗效与Tim-3基因表达量呈明显负相关(r=-0.987，P< 0.05)，与患者性别、年龄无相关性(P> 0.05)。

3 讨论

急性白血病是由于造血干、祖细胞在较早阶段发生增殖失控及凋亡受阻和分化障碍而引发的造血系统恶性肿瘤，患者经过化疗及骨髓抑制治疗后其生存期得以有效延长，但缓解后患者复发率仍较高，因而一直以来急性白血病死亡率仍居高不下[6]。急性白血病属于一组形态学、细胞遗传学及免疫分型和分子生物学等存在明显差异的异质性疾病，而白血病干细胞被认为是急性白血病患者对化疗药物耐药有一定关系。

Tim-3自2002年第一次被发现以来，其作为重要的细胞免疫负调控因子，其可通过不同机制介导肿瘤微环境中的免疫抑制，在各类肿瘤发生、发展及转移中发挥重要作用[7]。如有学者研究指出Tim-3可异位表达于非造血细胞肿瘤细胞中，尤其是原发性癌细胞(如黑色素瘤、脂肪肉瘤、非小细胞肺癌及宫颈癌等)[8]；另有学者研究指出Tim-3在白血病干细胞中存在高表达现象[9]，国外学者的动物实验研究表明抗人Tim-3的鼠IgG2α抗体可在不损伤机体HSCs的同时阻止白血病细胞在小鼠体内重建[10]，初步证实了Tim-3在急性白血病疾病发生、进展等病理过程中发挥重要作用。本研究结果显示治疗前研究组外周血T细胞Tim-3比率及Tim-3 mRNA相对表达量高于健康组及研究组治疗后，而健康组外周血T细胞Tim-3比率及Tim-3 mRNA相对表达量与研究组治疗后无显著差异，还显示Tim-3基因PCR产物反应具有特异性，相关性分析显示急性白血病患者临床疗效与Tim-3基因表达量呈明显负相关，初步证实了Tim-3基因在急性白血病患者中存在高表达现象，体现出Tim-3在急性白血病的发生及进展中具有明显调节作用，与既往文献报告相符[11]，且其表达水平高低在急性白血病患者临床疗效的评估中有着重要临床意义，与早期学者研究指出Tim-3在胃癌细胞中的高表达与患者预后呈明显负相关的结论相符[12]，此外国外学者研究还指出Tim-3在除了M3的大多数亚型急性白血病干细胞中高表达，但其在健康造血干细胞中几乎不表达也表明了这一点[13]。本研究结果提示，在急性白血病患者免疫病理过程中，Tim-3可通过在T细胞的表达变化，调节机体免疫反应，其可持续表达于CD4+、CD8+T细胞分裂阶段，在第6个细胞周期达至峰值，因而Tim-3在急性白血病患者中存在高表达现象。

综上，急性白血病治疗前后外周血Tim-3表达水平存在明显差异，Tim-3表达水平高低在急性白血病患者临床疗效评估中有着重要临床意义。

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ExpressionlevelandsignificanceofTcellimmunoglobulinmucin3inperipheralbloodmononuclearcellsbeforeandaftertreatmentinpatientswithacuteleukemia

WUXiang-ling

(DepartmentofMicrobiologyandImmunology，NorthSichuanMedicalCollege，Nanchong637007，China)

ObjectiveTo investigate the expression level and significance of T cell immunoglobulin mucin 3 (Tim-3) in peripheral blood mononuclear cells before and after treatment in patients with acute leukemia.MethodsTwenty-five patients with acute leukemia treated in our hospital from February 2015 to March 2017 were selected as study group，and 25 healthy volunteers having physical examination or bone marrow of donors during the same period in our hospital were denoted as healthy group.After isolation of mononuclear cells，RNA was extracted and the patients were treated with standard chemotherapy.The expression level of Tim-3 mRNA in monocytes was detected by real-time qPCR.ResultsThe Tim-3 ratio in peripheral blood T cells and the relative expression level of Tim-3 mRNA in the study group before treatment were significantly higher than those in the healthy group and in the study group after treatment group (P< 0.05).The Tim-3 ratio in peripheral blood T cells and the relative expression of Tim-3 mRNA in the study group after treatment were not significantly different from those in the healthy group (P> 0.05).There was a negative correlation between clinical curative effect and expression levels of Tim-3 mRNA.ConclusionTim-3 gene is highly expressed in patients with acute leukemia.Its expression level plays a role in evaluation of the therapeutic effect of the patients.

Acute leukemia；Treatment；Tim-3；Clinical significance

川北医学院科研发展重点项目(编号：CBY15-A-ZD13)

R733.71

A

1672-6170(2017)05-0085-03

2017-03-21；

2017-05-23)