Taqman定量PCR检测宫颈癌样本中CXCL12和CXCR4基因表达水平

彭端亮，刘成桂，缪晓燕，刘于嵩，宋 建，钱金凤

(1.四川省医学科学院·四川省人民医院城东病区检验科，四川 成都 610101；2.成都市妇女儿童中心医院，四川 成都 610091)

Taqman定量PCR检测宫颈癌样本中CXCL12和CXCR4基因表达水平

彭端亮1，刘成桂2，缪晓燕1，刘于嵩1，宋 建1，钱金凤1

(1.四川省医学科学院·四川省人民医院城东病区检验科，四川 成都 610101；2.成都市妇女儿童中心医院，四川 成都 610091)

目的探讨CXCL12和CXCR4基因检测在宫颈癌病变筛查中对宫颈癌早期诊断及其淋巴结转移检测的效果。方法选择2015年1月至2016年9月在我院妇产科就诊的宫颈癌患者113例为癌症组，另选同期正常宫颈组织20例作为正常对照。观察不同病理分型中CXCL12和CXCR4检测结果，以及CXCL12和CXCR4 mRNA检测准确性、特异性以及重复性等指标，分析不同临床病理指标的宫颈癌样本和正常宫颈样本中CXCL12和CXCR4 mRNA的表达量的变化。结果多重荧光定量体系的准确性、特异性和检测线性结果均满足设计要求，采用标准曲线法评估试剂的重复性。结果显示，标准曲线呈现良好的线性梯度和重复性。对实际临床样本进行检测，确定宫颈癌组织中CXCR4 mRNA表达量和正常组织中上调明显，2-ΔCt等于或大于(3.01±0.09)，不同临床分型结果或者肿瘤病理类型差异无统计学意义(P> 0.05)；而当淋巴结组织中出现转移的情况下，CXCL12的下调至(0.09±0.02)，与无淋巴组织转移的肿瘤(0.19±0.2)差异有统计学意义(P< 0.05)。结论CXCL12和CXCR4可以作为早期生物标志物，可以在宫颈癌早期检测中发挥重要作用，采用荧光定量PCR方法结合2-ΔCt计算方法具有理想的效果，适合临床进一步研究和推广。

宫颈癌；CXCL12；CXCR4；基因表达；荧光定量PCR

宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一，高发年龄为50～55岁，严重影响女性健康[1]，近年来发病有年轻化趋势[2]。目前普遍认为高危型人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)的持续感染时发展成宫颈癌的主要因素，但目前并没有针对高危型人乳头瘤病毒的有效治疗手段，所以通过宫颈细胞学筛查，使宫颈癌和癌前病变得以早期发现和治疗，依旧是降低宫颈癌的发病率和死亡率的有效途径。最近，肿瘤标志物的研究越来越被研究人员重视，是可以有效提示肿瘤存在和生长的一类物质[3]。研究表明，肿瘤组织中，特别是在细胞浸润的边缘——趋化因子受体系统表达出现明显的变化，并且这种变化出现在组织内绝大部分的肿瘤细胞中[4]，趋化因子是一类能趋化细胞定向移动的小分子碱性蛋白，迄今已发现40多种人的趋化因子，根据半胱氨酸的位置不同可以分为C、CC、CXC和CX3C四个亚族。趋化因子及其受体在人体内作用十分广泛，他们不仅对白细胞具有趋化作用，并且再炎症反应、肿瘤形成和转移等方面都发挥着广泛的作用。其中趋化因子CXCL12及其受体CXCR4可以通过激活多种信号通路的方式在肿瘤细胞增殖、肿瘤血管生长和肿瘤侵袭转移等多种生物学行为中起重要作用[5]，越来越受到研究者的重视，可以成为理想的肿瘤发生及转移的标志物。

目前国内外主要采用荧光染料法对CXCR12或CXCR4基因进行检测[6～8]，由于荧光染料的原因，至少需要3管(CXCR12，CXCR4和内参基因)扩增体系，操作费时费力，并且成本较高，所以为了解决这个问题，本文拟通过设计CXCL12和CXCR4的单管三重Taqman荧光定量PCR体系对宫颈癌组织中CXCL12和CXCR4基因的表达进行检测，探讨CXCL12和CXCR4作为宫颈癌早期诊断肿瘤标记物的意义。

1 资料与方法

1.1一般资料选择2015年1月至2016年9月在我院妇产科就诊的宫颈癌患者113例为癌症组(I A1期14例，I A2期23例，I B2期25例，II A1期30例，II A2期21例)，年龄(49±5)岁；子宫颈癌分期根据《妇产科学》第八版进行临床分期[10]。另选同期正常宫颈组织20例作为正常对照。入选病例均不伴有其他恶性肿瘤疾病。

1.2主要试剂和仪器Hela细胞为实验室自存，GAPDH、CXCL12和CXCR4基因假病毒购自苏州金唯智生物科技有限公司，Trizol Reagent购自美国Invitrogen公司。superscript逆转录试剂盒购自Thermofisher公司。ABI 7500荧光定量PCR仪为美国ABI公司产品。

1.3方法

1.3.1PCR反应引物及探针的设计 CXCR4基因、CXCL12基因和内参基因的引物和荧光检测探针采用primer5软件，根据NCBI上下载的人CXCL12和CXCR4基因下载的序列设计，引物和探针均由上海生工生物工程股份有限公司合成，核苷酸序列和扩增片段长度，见表1。荧光定量PCR体系及反应条件。

表1 引物探针序列

1.3.2总RNA的提取 取冷冻保存的宫颈癌组织和正常宫颈组织0.1～0.2 g，采用Trizol法提取组织RNA，操作严格按照说明书步骤进行。

1.3.3一步法逆转录定量PCR PCR反应采用一步法进行扩增，扩增体系体积为50 μl，包含1×superscrpt buffer，引物(各8 pmol)，荧光探针(各4 pmol)，5 μl RNA模板。扩增反应条件为：50 ℃ 15 min，94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s 共50个循环。

1.4构建标准品和标准曲线以采购的CXCL12和CXCR4基因假病毒为标准品，使用确定浓度的人基因组(10 ng/μl)进行梯度稀释[体积比为105copies/ μl]，共稀释5个梯度，以稀释后的标准品为模板进行荧光定量PCR，以ΔCt[Ct(target gene)-Ct(GAPDH)]为纵坐标，标准品稀释倍数为横坐标作图，制作得到标准曲线。

1.52-ΔCt法对CXCR12和CXCR14基因的表达水平通过相对定量的方法进行计算，采用目的基因与内参基因之间Ct值之间的差异来确定目的基因的表达量，本实验中，以GAPDH作为内参基因，所以，每一个样本的ΔCt=Ct(target gene)-Ct(GAPDH)。

1.6统计学方法采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析。组间CXCR4和CXCR12 mRNA表达的比较采用Mann-Whitney检验。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1荧光定量PCR体系的验证

2.1.1引物探针检测准确性及特异性 将三种不同基因的引物和探针配置成单管单重体系，对三种基因的假病毒进行检测，检测结果显示三种基因的引物和探针均可以特异性检出对应假病毒的结果，而对于其它假病毒检测并未出现非特异曲线，见图1a。

图1 荧光定量体系验证结果 a：CXCR4引物验证结果，四个梯度下，扩增曲线呈线性关系，CXCL12和GAPDH未见扩增曲线；b：多重荧光体系检测结果，三个基因出现明显扩增曲线

2.1.2多重荧光定量PCR 将三种不同基因的引物和探针配置成单管多重PCR体系，对三种假病毒及Hela细胞进行验证，结果显示三种假病毒检测准确性和特异性未发生变化，但Ct值有所下降，而Hela细胞结果显示，三个荧光通道均出现荧光曲线，表明多重荧光定量PCR体系检测准确性和特异性效果良好，见图1b。

2.1.3检测线性 对Hela细胞进行梯度稀释，对稀释的样本进行检测，结果显示，单管多重体系检测线性良好，相同梯度稀释下Ct值变化成线性关系变化，目的基因与管家基因之间2-ΔCt值变化差异无统计学意义，见图2。

图2 线性检测结果 a:CXCR4结果;b:CXCL12结果;c:GAPDH结果

2.2标准曲线对人工合成的CXCL12和CXCR4浓度梯度稀释的标准曲线进行测定，因本实验采用ΔCt法，不计算绝对含量，标准曲线用于评估试剂的重复性。结果显示，标准曲线呈现良好的线性梯度和重复性，R2= 0.9966，见图3。

图3 CXCL12基因标准曲线的可行性和重复性

2.3荧光定量PCR检测CXCL12基因在宫颈组织中mRNA表达结果由表2可见，无淋巴结转移的宫颈癌组织中CXCL12 mRNA表达水平与正常组织表达量差异无统计学意义(P> 0.05)，有淋巴结转移与无淋巴结转移的宫颈癌组织中CXCL12 mRNA表达水平差异有统计学意义(P< 0.05)。

表2 宫颈癌患者盆腔淋巴结组织中CXCL12基因mRNA表达水平比较

﹡与无淋巴结转移比较，P< 0.05

2.4荧光定量PCR检测CXCR4基因在宫颈组织中mRNA表达结果与CXCL12基因不同，CXCR4基因在正常组织和宫颈癌组织中mRNA表达水平出现明显上调，同时，宫颈癌出现淋巴结转移时，CXCR4基因的表达量出现表达上调的情况更加明显(P< 0.05)，见表3。

表3 不同临床病理指标的宫颈癌患者癌组织中CXCR4基因表达水平的比较

﹡与无淋巴结转移比较，P< 0.05

3 讨论

趋化因子CXCL12，是趋化因子家族中被研究最多的成员之一[11～14]，在许多组织中表达，参与多种生理发育过程。CXCR4是CXCL12的受体，与其一同构成CXCL12-CXCR4生物学轴，通过激活细胞内多种信号传导通路，调节细胞的增殖和侵袭能力，从而参与恶性肿瘤的增殖、侵袭转移等过程中，与肿瘤的发生，发展有密切的关系。已有研究表明CXCL12和CXCR4基因mRNA的表达水平与子宫颈癌的发生和发展具有相关性，是潜在的肿瘤标志物。

目前国内外文章中主要采用溶解曲线法对肿瘤组织内的CXCL12和CXCR4基因进行检测，如果需要同时对这两个基因进行检测分析，则需要三管扩增体系(CXCR12，CXCR4和内参基因)，操作较为繁琐，并且扩增过程中也可能因为仪器不同区域温度误差、人为操作等因素导致结果分析出现不必要的误差，而采用Taqman探针[15～17]可以选择多种荧光标记物，采用多重扩增检测的方法在一管体系中同时检测CXCL12和CXCR4两种目的基因和内参基因，避免因为仪器原因而导致的误差以及更加节约成本。本文通过采用FAM，Hex和CY3三种荧光标记物标记在三个基因的特异性荧光探针上，制备成单管三种荧光定量PCR体系，可以同时检测CXCL12，CXCR4和内参基因(GAPDH基因)。通过Hela细胞作为样本的测试结果表明，该体系的检测效果好，检测线性、特异性等性能均满足实验要求。采用标准曲线方法对试剂和仪器的重复性和可靠性进行检测，可以知道试剂呈现良好的线性梯度和重复性，适合临床应用的需求。

本研究发现，CXCR4基因在正常宫颈样本及宫颈癌组织样本中表达水平有明显的不同，并且宫颈癌组织样本中，出现淋巴结转移的宫颈癌组织CXCR4基因mRNA表达量相较未出现的淋巴结转移的表达量上调更加明显，而CXCR4表达量与病理分级，病理类型等指标相关性不大，说明CXCR4基因的高表达可以成为是否有肿瘤发生以及是否转移的一个指标。于此同时，CXCL12基因在有转移淋巴结组织相较无转移淋巴结组织中出现了表达水平明显下调的情况，而在宫颈癌组织中表达量未出现明显变化，这个结果与Muller等[14]研究的乳腺癌最常见转移部位CXCL12表达变化相类似，这个f结果表明CXCL12基因可以作为很好的是否发生淋巴结转移的。综合以上结果可以看出，针对宫颈及周围盆腔淋巴结组织中的CXCL12及CXCR4基因mRNA进行检测，可以较好的作为宫颈癌是否存在以及是否发生转移的很好的指标。对临床样本进行荧光定量分析，并采用2-ΔCt的计算方法进行分析，当CXCR4基因2-ΔCt等于或大于(3.01±0.09)时，高度怀疑宫颈癌的出现，而当淋巴结组织中出现CXCL12表达量低于(0.09±0.02)时，表明出现淋巴结组织转移的可能性增大。

总之，本研究设计的单管多重Taqman荧光定量PCR试剂可以很好的检测出CXCL12和CXCR4基因在宫颈癌组织及盆腔淋巴结组织中的表达量，并且通过分析CXCL12和CXCR4基因的表达量可以作为子宫颈癌发生及发展的很好的肿瘤标志物。

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TheexpressionsofCXCL12andCXCR4incervicalcancerdeterminedbyusingTaqmanreal-timePCR

PENGDuan-liang1，LIUCheng-gui2，MIUXiao-yan1，LIUYu-song1，SONGJian1，QIANJin-feng1

(1.ClinicalLaboratory，EastBranch，SichuanAcademyofMedicalSciences&SichuanProvincialPeople’sHospital，Chengdu6101012，China；2.ChengduWomen&Children’sCentralHospital，Chengdu610091，China)

ObjectiveTo investigate the effect of detection of mRNA expression levels of CXCL12 and CXCR4 in early diagnosis and lymphatic metastatic diagnosis of cervical cancer.MethodsFrom January 2015 to September 2016，113 patients with cervical cancer treated at department of gynecology and obstetrics were taken as cancer group.Meanwhile，20 patients with healthy cervical tissue were taken as control group.The results of CXCL12 and CXCR4 in different pathological types，and the accuracy，specificity and repeatability of the detection of mRNA expression of CXCL12 and CXCR4 were observed.The changes of CXCL12 and CXCR4 mRNA expressions between the cervical cancer samples and normal cervical tissues as well as among the various clinicopathological parameters were compared.ResultsThe accuracy，specificity and measuring linearity of Taqman real-time PCR met the design requirements.Standard curve results showed good repeatability.In cervical cancer tumor，the expression levels of CXCR4 mRNA were increased (2-ΔCt= 3.01 ± 0.09).However，there was no significant difference in CXCR4 mRNA expression among clinical stages and pathological patterns (P> 0.05).When the tumor was metastatic，the expression levels of CXCL12 mRNA were reduced (2-ΔCt= 0.09 ± 0.02) that was significantly lower than that in cancer without metastasis (2-ΔCt= 0.19 ± 0.20) (P< 0.05).ConclusionCXCL12 and CXCR4 could be used as biomarkers that may play an important role in early diagnosis of cervical cancer.The real time PCR combined the calculation method of 2-ΔCtcould reach idea results that will be suitable for clinical further promotion.

Cervical cancer；CXCL12；CXCR4；Expression；real-time PCR

R446.11；R737.33

A

1672-6170(2017)05-0016-04

2017-03-21；

2017-05-23)