结直肠癌MICA基因的表达与p53 K-ras基因突变的关系研究*

谷敬锋, 王桂琦, 刘海霞, 高英超, 王园园

(1.河北医科大学第一医院, 河北 石家庄 0500312.河北省石家庄市第一医院， 河北 石家庄 050011)

结直肠癌MICA基因的表达与p53 K-ras基因突变的关系研究*

谷敬锋1, 王桂琦1, 刘海霞2, 高英超1, 王园园

(1.河北医科大学第一医院, 河北 石家庄 0500312.河北省石家庄市第一医院， 河北 石家庄 050011)

目的：分析结直肠癌MICA基因的表达与p53、K-ras基因突变的关系。方法:回顾性分析我院2014年3月至2016年3月收治的66例结直肠癌患者的临床资料，应用半定量PCR-SSCP技术，对癌组织mdr1基因表达量与p53、K-ras进行检测，并分析结直肠癌MICA基因表达与p53、K-ras基因突变间的相互关系。结果:经研究发现，MICA表达与结直肠癌患者肿瘤部位、年龄、性别无相关性(P>0.05)。于66例患者中，22例淋巴结转移者的MICA平均表达量明显高于淋巴结未转移者，差异具有统计学意义(P<0.05)。8例K-ras、p53基因联合突变者MICA基因平均表达量高于非联合突变者，差异具有显著统计学意义(P<0.05)，12例K-ras基因突变者MICA平均表达量稍高于未突变者，但比较差异无统计学意义(P>0.05)，16例p53基因突变者MICA平均表达量显著优于p53基因未突变者，差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:MICA基因高表达已成为了结直肠癌的关键检测指标，而p53、K-ras基因与其高表达具有相关性。

MICA基因； K-ras基因； p53基因； 结直肠癌

与正常结直肠组织相比，结直肠肿瘤中，MICA表达水平相对较高[1]。目前，针对结直肠癌发病机制研究有多种。诸多分子生物学研究提示,针对肿瘤细胞而言，其对化疗应答敏感性的靶点在于细胞基因型，化疗制剂基因毒性对其无明显影响[2,3]。现阶段，利用基因型对肿瘤化疗敏感性进行预测已逐渐引起了临床研究者的重视。为了深入探究结直肠癌MICA基因的表达与p53、K-ras基因突变的关系，本文主要对我院2014年3月至2016年3月收治的66例结直肠癌患者的临床资料进行回顾性分析，相关报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料:本组选择我院于2014年3月至2016年3月收治的结直肠癌患者66例为研究对象，均经活检组织病理学检查确诊，其中男性36例，女性30例，年龄(22～54)岁，平均年龄(37.28±2.17)岁；22例DukeA期，23例DukeB期，10例DukeC期,11例DukeD期；53例行结直肠癌根治术，13例行姑息性切除术。

1.2 方法:①结直肠癌基因组DNA提取：经液氮留存癌旁组织、癌组织与正常组织匀浆，通过蛋白酶K行消化处理，并结合酚/氯仿进行抽提，于冷无水乙醇中予以沉淀、溶解(0.1×TE)，最后留存备用；②引物设计：K-ras、p53基因引物序列依据相关文献[1]来进行，由上海瀚为生物科技有限公司合成；③PCR反应：该反应总体积达50μL，于94℃环境下，PCR循环仪变形达至75s，于54℃环境下退火60s，72℃下拓宽至60s。依照上述方法反复35次，最终于75℃环境下延伸至300s；④电泳与银染：择取5μLPCR产物，加入5μL缓冲液混合，于98℃环境下变形处理600s，完毕后冰浴骤冷300s[4]。继后，加入8%的聚丙烯酰胺，行电泳处理，持续5h，并行银染鉴定。

1.3 观察指标:检测癌组织MICA基因表达量与p53、K-ras基因突变状况。MICA基因检测步骤：

1.3.1 标本采集:经液氮留存癌旁组织、癌组织与正常组织匀浆，贮存在-20℃以下待实验。

1.3.2 标本DNA提取:采用Pel-Freeze DNA商用抽提试剂盒。

1.3.3 2-6外显子测序分析:①PCR扩增:引物参照MICA基因序列，采用两对引物分别对2-6外显子进行扩增。其中第1对引物可扩增MICA 2-5号外显子，另1对引物扩增第5、6号外显子。PCR引物序列和扩增条件参照正文，扩增反应体系总体积为25μL。②PCR产物纯化:每孔中加进核酸外切酶Ⅰ1μL(5U)，虾碱性磷酸酶2μL(2U)，ABI公司的9700型PCR自动扩增仪进行酶切反应，37℃30min，80℃15min。③测序反应:分别针对外显子2、3、4、5、6设计测序引物，进行双向测序。以纯化PCR产物为模板按BigDye Sequencing kit(ABI公司)试剂盒操纵进行测序反应，ABI公司9700型PCR自动扩增仪扩增，扩增条件为95℃预变性5min，95℃30s，50℃10s，60℃4min，30个循环，冷却至4℃。④测序反应纯化和电泳分析:采用乙醇/醋酸钠法纯化，然后在ABI 3730测序仪上进行测序电泳分析。⑤测序结果分析和判定:采用Assign 3.5分析软件和MT Navigator软件进行数据分析，由Assign 3.5软件指定终极结果。

1.3.4 GeneScan检测5号外显子GCT重复数目：①GeneSean扩增:引物参照有关文献，正向引物5'端标记有FAM荧光团体。引物序列和扩增条件参照正文，扩增反应体系为20μL。②GeneScan上机检测:GeneScan扩增产物1:10稀释后，取5μL PCR产物4.8μL甲酰胺0.2μL内标充分混匀，95℃4min变性后，在ABI 3730测序仪上进行GeneScan模式分析。③GeneScan结果分析和判定:采用GengMapper v3.7自动判定结果，根据片断长度大小推测GCT重复次数，并与5号外显子测序结果进行验证。

1.3.5 MICA缺失型等位基因检测:采用PCR-SSP的方法，引物参照有关文献[5]，一对引物扩增MICA*Del等位基因的守旧序列，另外一对引物扩增人类生长激素的同源守旧序列，扩增反应体系为10μL。

2 结 果

2.1 淋巴结转移组与淋巴结未转移组间的MICA表达分析:经研究发现，MICA表达与结直肠癌患者肿瘤部位、年龄、性别无相关性(P>0.05)。66例患者中，22例淋巴结转移者的MICA平均表达量明显高于淋巴结未转移者，差异具有统计学意义(P<0.05)，详见表1。

表1 淋巴结转移组与淋巴结未转移组间的MICA表达分析

注：*与淋巴结未转移组比较差异有统计学意义(P<0.05)

2.2 K-ras、p53基因联合突变者与非联合突变者间的MICA表达分析:8例K-ras、p53基因联合突变者MICA基因平均表达量高于非联合突变者，差异具有显著统计学意义(P<0.05)，详见表2。

2.3 K-ras基因突变组与未突变组的MICA表达分析:12例K-ras基因突变者MICA平均表达量稍高于未突变者，但比较差异无统计学意义(P>0.05)，详见表3。

表2 K-ras、p53基因联合突变者与非联合突变者间 的MICA表达分析

注：*与非联合突变组比较差异有统计学意义(P<0.05)

注：*与未突变组比较差异有统计学意义(P<0.05)

2.4 p53基因突变组与未突变组的MICA表达分析:16例p53基因突变者MICA平均表达量显著优于p53基因未突变者，差异具有统计学意义(P<0.05)，免疫组化显示正常结直肠导管上皮细胞MICA表达阴性(-)；高分化结直肠癌MICA表达弱阳性(+)；中低分化结直肠癌MICA表达阳性(++)；低分化结直肠癌MICA表达强阳性(+++)。详见表4。

表4 p53基因突变组与未突变组的MICA表达分析

注：*与未发生突变组比较差异有统计学意义(P<0.05)

图1 正常组织、结直肠癌MICA免疫组织染色

分别为100(上)、400(下)倍镜下表现；(A1，2) 正常结直肠导管上皮细胞MICA表达阴性(-)；(B1，2) 高分化结直肠癌[67岁，T1N0M0，Gleason 3，MICA表达弱阳性(+)]；(C1，2) 中低分化结直肠癌[59岁，T2N0M0，Gleason 7，MICA表达阳性(++)]；(D1.2)低分化结直肠癌[72岁，T2N1M0，Gleason 9，MICA表达强阳性(+++)]。

3 讨 论

结直肠癌形成过程中，原癌基因ras与抑癌基因p53突变属于其常见基因改变现象。据有关统计发现，结直肠癌细胞中，p53基因突变约占50%～80%,多为第7、8外显子；而ras基因突变多为K-ras基因第12位点，其突变率约为50%[6]。研究发现，对17例Duckes D期结直肠癌患者术后予以5-Fu治疗，经p53基因检测提示突变者预后与未接受5-Fu治疗者无明显差异；而与未行5-Fu治疗者比较，p53基因未突变者接受5-Fu治疗后平均生存期为其4倍左右,表明化疗疗效与p53基因状态相关[7,8]。p53在MICA基因产物P-糖蛋白的影响下可诱导细胞毒性药物复合物外流，进而抑制DNA损伤[9]。本文研究结果发现，结直肠癌组织(p53基因突变)中,与未突变者比较,突变者MICA表达量存在明显差异；与K-ras、p53基因未发生联合突变者比较，联合突变者MICA表达量明显较高,充分证实结直肠癌MICA基因高水平表达与K-ras、p53基因突变密切相关。

通常而言，p53基因对细胞耐药性的影响多经由影响WT1基因表达来实现。WT1基因属于抑癌基因之一，对MICA基因表达具有调节作用，而诱导耐药的主要蛋白属于MICA基因产物P-gp蛋白。在本文研究中，MICA表达量与K-ras基因突变间的差异无明显变化，但针对K-ras基因突变者而言，其MICA表达量处于较高状态,而两基因联合突变者明显增高，故MICA基因表达与K-ras基因突变间具有一定的关联性。究其作用途径，于肿瘤发生过程中，p53、K-ras基因突变可激活MICA启动子，进而诱导MICA基因高水平表达。于本文研究中，22例结直肠癌转移者MICA基因表达量明显上升。目前，分子生物学技术不断发展，临床诸多研究证实肿瘤细胞命运主要取决于细胞基因型，MICA基因高表达已成为了结直肠癌检测的关键指标。

综上所述，结直肠癌MICA基因高水平表达与K-ras、p53基因密切相关，这对结直肠癌检测，及预防天然耐药具有一定的指导作用，应引起足够重视。

[1] 陈曦.中国人结直肠癌中APC、p53、K-ras和PIK3CA基因突变的研究[D].安徽医科大学,2012.

[2] 马列,赵明静,王群,李秀林,王笑歌.结直肠癌p53、FHIT、K-RAS基因突变与吸烟相关性Meta分析[J].现代肿瘤医学,2011,26(10):1982～1987.

[3] 李婷婷.HOXB7激活WnT/β-Catenin信号通路促进结直肠癌侵袭转移的分子机制[D].南方医科大学,2013.

[4] 赵莉.结直肠癌临床特点及癌变相关分子机制的异同分析[D].北京协和医学院,2010.

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The Relationship between MICA Gene Expression ofBladder Cancer and Mutation of p53 and K-ras Gene

GUJingfeng,WANGGuiqi,etal

(TheFirstHospitalofHebeiMedicalUniversity,HebeiShijiazhuang050031,China)

Objective:To investigate the relationship between the expression of MICA gene in bladder cancer and the mutation of p53 gene and K-ras gene. Methods: 66 cases of bladder cancer patients with clinical data in our hospital from March 2014 to March 2016 were analyzed. Semi quantitative PCR-SSCP technique was used to detect the expression of MDR1 gene and p53 and K-ras in cancer tissues, and analyzed the relationship between the expression of MICA gene in colorectal cancer and the mutation of p53 and K-ras genes. Results: The study found that there was no correlation between the expression of MICA and the location, age and sex of the patients with colorectal cancer (P > 0.05). In 66 patients, the mean expression of MICA in 22 lymph node metastasis patients was higher than that without lymph node metastasis, and the difference was statistically significant (P < 0.05). 8 cases of K-ras and p53 gene expression of the MICA gene mutation combined with average weight is higher than non mutation, the difference was statistically significant (P < 0.05), 12 cases of K-ras gene mutation MICA average expression was slightly higher than that without mutation, but the difference was not statistically significant (P > 0.05), 16 cases of p53 gene mutation MICA expression was significantly better than the average mutation in the p53 gene, the difference was statistically significant (P < 0.05). Conclusion: The high expression of MICA gene has become a key indicator for the detection of bladder cancer, and the correlation between K-ras and p53 gene and its high expression.

MICA gene; K-ras gene; p53 gene; Bladder cancer

河北省卫计委资助项目，(编号20160203)

1006-6233(2017)08-1233-04

A

10.3969/j.issn.1006-6233.2017.08.001

论 著