披针骨牌蕨总黄酮对高糖诱导血管内皮细胞氧化损伤的保护作用

张 伟，罗 优，李亚婷，胡晓峰，唐伟军，彭梁杰

（湘南学院，湖南 郴州 423000）

·实验研究·

披针骨牌蕨总黄酮对高糖诱导血管内皮细胞氧化损伤的保护作用

张 伟，罗 优，李亚婷，胡晓峰，唐伟军，彭梁杰

（湘南学院，湖南 郴州 423000）

目的 探讨披针骨牌蕨总黄酮对血管内皮细胞氧化损伤的保护作用。方法 建立高糖诱导的人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）氧化损伤模型进行药物试验，分为正常对照组(葡萄糖质量浓度为5.5 mmol／L)、高糖损伤模型组（葡萄糖质量浓度为40 mmol／L)、提取物组（披针骨牌蕨总黄酮质量浓度分别为100，200，400 mg／L）、阳性对照组（维生素C质量浓度为30 mg／L）。以四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定细胞存活率，以试剂盒测定细胞中乳酸脱氢酶（LDH）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（NOS）释放量及活性的变化。结果 提取物组MDA释放量明显降低，LDH释放量及活性下降，SOD的活性明显增高，NO和NOS生成量及活性明显增高，具有显著性差异（P＜0.05），且在一定质量浓度范围内与披针骨牌蕨总黄酮呈剂量依赖性关系。结论 披针骨牌蕨总黄酮对高糖诱导HUVEC氧化损伤具有一定的保护作用，其作用机制可能与机体抗氧化酶活性增加、自由基清除、抗氧化能力提高有关。

披针骨牌蕨总黄酮；人脐静脉血管内皮细胞；高糖；氧化应激

披针骨牌蕨 Lepiologrammitis diversa Ching同为蕨类植物水龙骨科骨牌蕨属披针骨牌蕨的全草，《新华本草纲要》记载，其味微苦、涩，性平，入肺、肝二经，具有清热除湿、收敛止血的功效，主要用于治疗风湿性关节炎、小儿高热、肺热咳嗽、外伤出血。该药用植物中含有黄酮类化合物、花青素、绿原酸等多种生物活性成分[1]，黄酮类化合物具有抗炎[2]、抗氧化[3]、抗凋亡[4]、抗肿瘤[5]、抗菌[6]、调血脂和降血糖[7]等多种生物活性。关于披针骨牌蕨提取物的药效研究目前鲜有报道。本研究中采用体外培养人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）的方法，建立高糖诱导HUVEC的氧化损伤模型，进一步探讨披针骨牌蕨总黄酮对内皮细胞损伤的保护作用及其作用机制，为开发披针骨牌蕨总黄酮治疗心血管疾病提供参考。现报道如下。

1 材料、仪器与方法

1.1 材料与仪器

主要材料：披针骨牌蕨总黄酮(本研究室自备)；四甲基偶氮唑蓝（MTT，南京凯基生物科技有限公司）；Ⅱ型胶原酶，维生素 C（美国Sigma公司）；胰蛋白酶（美国Hyclone公司）；二甲基亚砜(DMSO，分析纯，美国Amresco公司）；RPMI1640培养基（美国Hyclone公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）。丙二醛（MDA，批号为20140101），乳酸脱氢酶（LDH，批号为20140211），超氧化物歧化酶（SOD，批号为20140131），一氧化氮（NO，批号为20140031），一氧化氮合酶（NOS，批号为20140125）试剂盒均购于南京建成生物工程研究所；其他试剂均为分析纯。健康新生儿脐带由湘南学院附属医院妇产科提供。

主要仪器：MCO－15A型CO2培养箱（日本三洋公司）；CKX41型荧光倒置显微镜（日本Olympus公司）；JHT－DDC型超净工作台（山东省济南洁康设备厂）；MK3型酶标仪（芬兰雷勃公司）；TGL－16G－A型台式低温离心机（上海安亭科学仪器厂）；LS－B50L－1型立式压力蒸汽灭菌器（江阴滨江医疗设备有限公司）；FA1604型电子分析天平（上海精密仪器公司）。

1.2 方法

药液制备：药材全草用水洗净，55℃鼓风干燥48 h，冷却后粉碎过筛，石油醚脱脂2 h，药渣真空干燥至恒重，备用。药渣以60%乙醇12倍量浸泡90 min，45℃下超声处理（功率为450 W），重复提取2次，每次45 min，合并滤液，经HPD－600型大孔树脂，乙醇洗脱，减压浓缩后，超纯水定容为披针骨牌蕨总黄酮溶液，以芦丁为标准液绘制标准曲线，三氯化铝法测定质量浓度。

细胞培养：取正常分娩的健康胎儿的脐带，用4℃PBS冲洗静脉内残血，剪去钳痕，灌注0.15%胶原酶，37℃温育15 min。收集消化液，并用4℃ PBS冲洗静脉，合并两液，以1 000 r／min转速离心10 min后弃上清液，用含20%胎牛血清RPMI－1640制成均匀的细胞混悬液，并接种细胞，37℃及5%CO2条件下培养。24 h后半量换液，待细胞生长融合至80%时，消化传代。试验用2～3代的细胞。

模型建立：选择对数期生长的细胞，0.25%胰蛋白酶消化后轻轻吹打，制成均匀的细胞混悬液，计数板计数后，调整细胞浓度为每1 mL 1×105个后，再接种于96孔板中，每孔接种200 μL，每组设4个复孔，待细胞贴壁达融合状态后，对照组加200 μL无血清培养基，模型组分别各加入用无血清培养基将葡萄糖配置为终质量浓度为10，20，30，40，50 mmol／L的培养液 200 μL，分别作用12，24，48，72，96 h后测定MTT，于490 nm波长处测定吸光度值（A），以 A计算细胞生长抑制率，用来确定造模的最终浓度和作用时间。

抑制率（%）＝（A对照组－A试验组）／A对照组×100%

影响试验：正常对照组只加培养液孵育；高糖损伤模型组在培养液中加40 mmol／L的葡萄糖诱导损伤48 h；提取物组预先在培养液中分别加入终质量浓度为100，200，400 mg／L的提取物总黄酮孵育24 h，再加入40 mmol／L的葡萄糖诱导损伤48 h；阳性对照组于培养液中加入维生素C(终质量浓度为30 mg／L)孵育24 h后，再加入40 mmol／L的葡萄糖应激损伤48 h。吸取细胞培养的上清液，严格按照试剂盒说明书方法，分别测定释放LDH，MDA，SOD，NO，NOS的含量及活性，试验重复3次，每次4个复孔，取均值，并判断细胞氧化应激损伤状况。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 模型评价

HUVEC分别在不同浓度的葡萄糖（10，20，30，40，50 mmol／L）中共同孵育不同的时间（6，12，24，48，72 h），于490 nm波长处检测细胞活力（OD），结果见表1和表2。与正常对照组（葡萄糖浓度为5.5 mmol／L）相比，10 mmol／L的葡萄糖作用72 h，20 mmol／L的葡萄糖作用48 h，30 mmol／L的葡萄糖作用24 h，40 mmol／L和50 mmol／L的葡萄糖均作用12 h。提示对 HUVEC的OD值具有明显抑制作用，并呈一定的时间和浓度依赖关系。各组葡萄糖对HUVEC活力的抑制率随着葡萄糖浓度的增加和作用时间的延长而持续升高。故选择40 mmol／L的葡萄糖作用48 h，抑制率接近30%，作为本试验的最佳造模条件。

2.2 对细胞SOD，MDA，LDH含量及活性的影响

与正常对照相组比较，高糖损伤模型组细胞培养上清液中细胞内SOD含量减少，活性显著下降，MDA的含量明显上升，LDH含量、活性增高，均有显著性差异（P＜0.01）。与高糖损伤模型组比较，提取物组具有抑制高糖损伤所致细胞脂质氧化损伤、清除机体产生的自由基的作用，表现为细胞抗氧化物酶SOD的活性升高，脂质过氧化物MDA的生成量减少，LDH的含量、活性下降，并与披针骨牌蕨总黄酮呈浓度－剂量依赖性关系。其中与低剂量提取物组有差异（P＜0.05），与中剂量提取物组和高剂量提取物组有显著性差异（P＜0.01）。详见表3。

表1 不同浓度葡萄糖对HUVEC OD值的影响（±s，n＝5）

表1 不同浓度葡萄糖对HUVEC OD值的影响（±s，n＝5）

注：与正常对照组比较， P＜0.05， P＜0.01。

组别正常对照组高糖损伤模型组 10 mmol／L 20 mmol／L 30 mmol／L 40 mmol／L 50 mmol／L 6 h 0.574±0.005 0.576±0.002 0.567±0.003 0.563±0.002 0.545±0.006 0.507±0.008 12 h 0.579±0.002 0.573±0.003 0.562±0.006 0.531±0.006 0.514±0.002 0.501±0.002 24 h 0.583±0.003 0.574±0.007 0.518±0.004 0.483±0.004 0.416±0.002 0.393±0.006 48 h 0.586±0.004 0.504±0.002 0.505±0.003 0.458±0.002 0.402±0.006 0.385±0.002 72 h 0.585±0.006 0.502±0.005 0.478±0.005 0.421±0.005 0.393±0.006 0.371±0.003

表2 不同时间和浓度的葡萄糖作用下HUVEC的抑制率（%，n＝5）

表3 披针骨牌蕨总黄酮对高糖诱导损伤HUVEC的SOD，MDA，LDH含量及活性的影响（±s，n＝4）

表3 披针骨牌蕨总黄酮对高糖诱导损伤HUVEC的SOD，MDA，LDH含量及活性的影响（±s，n＝4）

注：与正常对照组比较，＃P＜0.01；与高糖损伤模型组比较， P＜0.05， P＜0.01。表4同。

组别正常对照组高糖损伤模型组阳性对照组低剂量提取物组（100 mg／L）中剂量提取物组（200 mg／L）高剂量提取物组（400 mg／L）SOD（U／mL）21.356±0.213 15.985±0.218＃19.284±0.138 16.450±0.162 17.042±0.213 17.930±0.138 MDA（nmol／mL）0.278±0.082 0.770±0.070＃0.321±0.082 0.598±0.070 0.471±0.049 0.363±0.043 LDH（U／L）223.235±7.781 371.298±7.781＃297.267±3.720 323.462±2.278 307.517±2.630 296.128±3.720

表4 披针骨牌蕨总黄酮对高糖诱导损伤HUVEC的NO和NOS含量及活性的影响（±s，n＝4）

表4 披针骨牌蕨总黄酮对高糖诱导损伤HUVEC的NO和NOS含量及活性的影响（±s，n＝4）

组别正常对照组高糖损伤模型组阳性对照组低剂量提取物组（100 mg／L）中剂量提取物组（200 mg／L）高剂量提取物组（400 mg／L）NO（ mol／L）56.766±1.704 19.802±0.762＃39.604±0.762 26.073±0.660 30.363±0.762 34.984±1.078 NOS（U／mL）6.622±0.223 4.486±0.223＃6.179±0.037 4.918±0.043 5.474±0.026 6.031±0.043

2.3 对细胞NO生成量和NOS含量及活性的影响

与正常对照组比较，高糖损伤模型组NO的生成量和NOS的活性均明显降低（P＜0.01）。与高糖损伤模型组比较，不同质量浓度的提取物组NO合成量和NOS的活性均明显升高，且在一定浓度范围内与提取物呈剂量依赖性升高关系(P＜0.01)。详见表4。

3 讨论

心脑血管病变是糖尿病的主要并发症[8]。血管内皮细胞是保护血管通透性的重要屏障[9－10]，能合成、分泌多种细胞因子和调节保护血管活性物质的功能，在清除机体有害物质、对抗动脉粥样硬化、平衡血管张力、调节血液流变性起到了很好的保护作用。长期高血糖可引起内皮细胞膜脂质过氧化，血管内皮细胞的自身抗氧化能力下降，从而导致内皮细胞膜调节功能障碍和紊乱[11]。寻找保护血管内皮细胞活性的药物，是防治心脑血管疾病的靶点之一[12]。黄酮类化合物是植物代谢过程中产生的一类重要的天然有机化合物，其药理活性广泛，具有清除自由基、抗动脉粥样硬化、抗脂质氧化、抗炎等作用[13]。

本试验中通过建立高糖诱导HUVEC氧化应激损伤模型，初步探讨披针骨牌蕨总黄酮对血管内皮细胞的保护作用及可能的机制。MDA水平可以反映细胞膜发生脂质过氧化反应的强度，间接反映内皮细胞发生氧化应激后自身的损伤程度[14]；LDH是细胞损伤后的代谢产物，反映细胞膜的通透性和损伤程度；SOD则是细胞产生的一种抗氧化酶，是机体内清除自由基的第一道防线[15]。本研究结果显示，披针骨牌蕨总黄酮可使高糖损伤模型组的LDH和MDA释放量减少，SOD的活性明显增加，且均与披针骨牌蕨总黄酮呈浓度依赖性。说明披针骨牌蕨总黄酮可以改善氧化应激损伤引起的细胞膜通透性增加，增强细胞对抗脂质的氧化能力，保护内皮细胞膜的结构与功能的完整性，抵抗氧化应激对血管内皮细胞的损伤。

NO是反映细胞内皮功能的重要指标，经NOS催化由血管内皮细胞合成并分泌，具有调节内皮细胞舒张、抵抗平滑肌细胞增殖、抗血小板聚集等作用[16]，是心血管系统功能重要的调节因子，其水平的升高或降低均可导致血管功能紊乱[17]。高糖损伤模型组NO含量和NOS活性均显著降低。加入披针骨牌蕨总黄酮保护后，NO生成量和NOS活性均明显增高（P＜0.01），且与披针骨牌蕨总黄酮呈剂量依赖性，提示披针骨牌蕨总黄酮可通过调节NO生成量来保护内皮细胞免受氧化应激的损伤，且与披针骨牌蕨总黄酮呈质量浓度依赖性升高关系。

研究表明，披针骨牌蕨总黄酮对高糖诱导的HUVEC损伤模型具有明显的保护作用，可能通过增强抗氧化物酶的活性而减少脂质过氧化副产物的形成，从而减少HUVEC氧化应激后自由基的产生，且与总黄酮质量浓度成比例增强。初步作用机制可能与披针骨牌蕨总黄酮在对抑制脂质的氧化、抗衰老、抗自由基、增强抗氧化酶（SOD，NOS）的活性及NO的释放量有关。后续研究需进一步探讨披针骨牌蕨总黄酮对血管内皮细胞应激损伤的保护作用及作用机制，可对未来开发新型治疗心血管疾病的天然中药材提供理论支持。

[1]张怀民，杨 虹，郑海洲.天然黄酮类化合物防治心脑血管疾病的研究进展[J].中国新药与临床杂志，2016，35(10): 704－708.

[2]Han MH，Lee WS，Nagappan A，et al.Flavonoids isolated from flowers of Lonicera japonica Thunb.inhibit inflammatory responses in BV2 microglial cells by suppressing TNF－ and IL－through PI3K／Akt／NF－ B signaling pathways[J].Phytother Res，2016，30(11):1824－1832.

[3]Es－Safi NE，Ghidouche S，Ducrot PH.Flavonoids：hemisynthesis，reactivity，characterization and free radical scavenging activity[J].Molecules，2007，12(9):2228－2258.

[4]Vauzour D，Vafeiadou K，Rice－ Evans C，et al.Activation of pro－survival Akt and ERK1／2 signalling pathways underlie the anti－apoptotic effects of flavanones in cortical neurons[J].J Neurochem，2007，103(4):1355－1367.

[5]Mateen S，Raina K，Agarwal R.Chemopreventive and anti－cancer efficacy of silibinin against growth and progression of lung cancer[J].Nutr Cancer，2013，65(Suppl 1):3－11.

[6]Dastidar SG，Manna A，Kumar KA，et al.Studies on the antibacterial potentiality of isoflavones[J].Int J Antimicrob Agents，2004，23(1):99－102.

[7]García－ Díaz JA，Navarrete Vázquez G，García Jiménez S，et al.Antidiabetic，anti－hyperlipidemic and anti－inflammatory effects of tilianin in streptozotocin－nicotinamide diabetic rats[J].Biomed Pharmacother，2016，83:667－675.

[8]WHO Multinational Study Group.The WHO multinational study of vasculardis ease in diabetes[J].Diabetes Res Clin Pract，2002，56:S6.

[9]Middleton J，Americh L，Gayon R，et al.Endothelial cell phenotypes in the rheumatoid synovium:activated，angiogenic，apoptotic and leaky[J].Arthritis Res Ther，2004，6(2):60.

[10]Pan KY，Shen MP，Ye ZH，et al.Inhibitive effects of anti－oxidative vitamins on mannitol－induced apoptosis of vascular endothelial cell[J].J Zhejiang University Scientific B，2006，7(10): 825.

[11]邱模昌，蔡灵卿，王 芳，等. －胡萝卜素对高糖诱导的血管内皮细胞损伤的保护作用[J].南昌大学学报（医学版），2014，54(7):24－28.

[12]刘颖琳，刘耕陶.血管内皮细胞炎症反应与动脉粥样硬化的关系对药物研究的启示[J].中国药理学通报，2001，17(4): 361－364.

[13]蔡少妃，黄春荣.大豆异黄酮对去卵巢大鼠血清 SOD、TAOC及MDA的影响[J].中国生化药物杂志，2011，32（4）: 315－316.

[14]王 伟，尚 佳，廖国玲，等.宁夏枸杞总黄酮对高糖诱导损伤人脐静脉内皮细胞抗氧化作用的影响[J].宁夏医科大学学报，2015，37(6):605－608.

[15]潘会君，唐 宁，华晓东，等.中药调控一氧化氮合酶－一氧化氮系统的研究[J].中国实验方剂学杂志，2010，16(12):202.

[16]蔡 鹰，魏群利，陆晓和.回心草对脐静脉内皮细胞的保护作用及对分泌一氧化氮和一氧化氮合酶的影响[J].中国实验方剂学杂志，2009，15（7）:79－82.

[17]刘昭娅，胥 茜，唐义信，等.内皮型一氧化氮合酶活性的调节与心血管疾病的研究进展[J].中南大学学报（医学版），2016，41(6):632－636.

Protective Effect of Total Flavonoids from Lepiologrammitis Diversa on High Glucose－Induced Oxidative Damage in Vascular Endothelial Cells

Zhang Wei,Luo You,Li Yating,Hu Xiaofeng,Tang Weijun,Peng Liangjie
(Xiangnan University,Chenzhou,Hunan,China 423000)

Objective To investigate the protective effect of total flavonoids from Lepiologrammitis Diversa on high glucose－induced oxidative damage in vascular endothelial cells.Methods To establish oxidative damage models of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)induced by high glucose and to carry out drug test.The models were divided into the normal control group(the mass concentration of glucose was 5.5 mmol／L),high glucose injury group(the mass concentration of glucose was 40 mmol／L),extract group (the mass concentration of total flavonoids from Lepiologrammitis Diversa were 100,200,400 mg／L)and positive control group(the mass concentration of vitamin C was 30 mg／L).The cell survival rate was measured by MTT assay,the changes of release and activity of LDH,MDA,SOD,NO and NOS in cells were determined by diagnostic reagent kit.Results In the extract group,the release amount of MDA was decreased significantly,the release amount and activity of LDH was decreased significantly,the activity of SOD was increased significantly,and the quantity and activity of NO and NOS were increased significantly(P＜0.05),in a certain concentration range,and the totalflavonoidsfrom Lepiologrammitis Diversa showed dose dependentrelationship in a certain massconcentration range.Conclusion Total flavonoids from Lepiologrammitis Diversa have protective effect on oxidative damage induced by high glucose in HUVEC.The preliminary mechanism may be related to the increase of antioxidase activity,the scavenging of free radicals and the increase of antioxidant capacity.

total flavonoids from Lepiologrammitis Diversa;human umbilical vein endothelial cells;high glucose;oxidative stress

2017－05－09；

2017－05－31)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.15.001

湖南省卫生计生委科研计划项目[C2016047]；湖南省教育厅科学研究项目[16C1495]；湘南学院校级科研课题立项资助项目[2015XB10]；湖南省大学生研究性学习和创新性实验计划项目[湘教通〔2014〕248号－489]。

张伟（1980－），男，硕士研究生，讲师，研究方向为心血管生理，（电子信箱）123489839＠qq.com。

彭梁杰（1981－），男，硕士研究生，研究方向为心血管病理生理学，（电子信箱）23859771＠qq.com。

R285.5；R282.71

A

1006－4931(2017)15－0001－04