羊肚菌液体培养基的筛选

程远

(五常市宝龙店种子林场，黑龙江 哈尔滨 150200)

羊肚菌液体培养基的筛选

程远

(五常市宝龙店种子林场，黑龙江 哈尔滨 150200)

以5种不同的液体培养基配方(Y1：麦麸、黄豆粉；Y2：马铃薯、黄豆粉；Y3：马铃薯、酵母膏；Y4：麦麸、酵母膏；Y5：米糠、黄豆粉)对羊肚菌进行液体培养，结果表明：Y4培养基中菌球大小均匀、个数多为95个·(100 mL)-1，菌丝生物量最大，为10.24 g·L-1，菌丝粗多糖得率最高，为11.45%。在5种培养基中，麦麸、酵母膏培养基为最佳培养基。

羊肚菌；液体培养基；筛选

羊肚菌(morchellaesculentaL.Pars)俗称羊肚菜，阳雀菌[1]。是一种名贵的食药用真菌[2]。羊肚菌属于子囊菌亚门(Ascomycotina)，盘菌纲(Discomycetes)，盘菌目(Pezizaies)，羊肚菌科(Morchellaceae)，羊肚菌属(Morchella)[3-5]。主要分布于我国的云南、甘肃、四川、青海、黑龙江、宁夏、新疆等地[6]。羊肚菌无毒，性平，味甘寒，中医认为其具有益脾胃、提神、补脑的功能，可用于治疗脾虚滑泻，消化不良，气虚多痰等症[7]。近年来，研究者们发现羊肚菌具有抗氧化[8]、抗癌[9]、抗疲劳[10]、保肝[11]、保肾[12]、降低血脂[13]等功效。而羊肚菌的多糖是羊肚菌的重要活性物质之一，具有抗氧化、抗疲劳、抑肿瘤、抗菌、增强免疫力等多种药理活性。近年来，随着羊肚菌研究的深入，羊肚菌在医药、保健品、食品等领域具有广阔的开发前景。液体培养羊肚菌，具有速度快、周期短、成本低、无污染等优点。本文用5种不同的液体培养液培养羊肚菌，通过比较羊肚菌的菌丝体生物量和菌丝中粗多糖的含量，选择出最佳的培养基配方。

1 试验材料

1.1 平板菌种培养基配方

马铃薯200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨1 g，MgSO4·7H2O 1 g，KH2PO42 g，自来水1 000 mL，pH6。

1.2 液体培养基配方

Y1：麦麸4%，黄豆粉2%，玉米粉2%，葡萄糖2%，MgSO4·7H2O 0.1%，KH2PO40.2%，自来水1 000 mL；Y2：马铃薯20%，黄豆粉2%，玉米粉2%，葡萄糖2%，MgSO4·7H2O 0.1%，KH2PO40.2%，自来水1 000 mL；Y3：马铃薯20%，蛋白胨0.1%，酵母膏0.2%，葡萄糖2%，MgSO4·7H2O 0.1%，KH2PO40.2%，自来水1 000 mL；Y4：麦麸4%，蛋白胨0.1%，酵母膏0.2%，葡萄糖2%，MgSO4·7H2O 0.1%，KH2PO40.2%，自来水1 000 mL；Y5：米糠4%，黄豆粉2%，玉米粉2%，葡萄糖2%，MgSO4·7H2O 0.1%，KH2PO40.2%，自来水1 000 mL。

2 试验方法

2.1 平板菌种的制备

按照1.1的培养基配方，加入18 g琼脂，制成羊肚菌培养基，倒入三角瓶内于121 ℃下的高压灭菌锅中灭菌20 min。灭好菌后，在无菌操作台中趁热将培养基导入平板中，水平放置到室温。待平板培养基冷却后，用灭菌的接菌勾取一小块试管种置于平板培养基的中央。接好菌后用封口膜封好，将平板培养基置于培养箱内，保持温度25 ℃，待菌丝长满平板后备用。

2.2 液体种的制备

按照1.2的不同培养基配方制备液体培养基，调节到pH6.5。将制备好的液体培养基导入500 mL三角瓶内，每瓶200 mL，将倒好培养基的三角瓶放入121 ℃高压灭菌锅内灭菌30 min。灭菌的液体培养基冷却至室温，在无菌操作台中，将平板培养基用打孔器在同一半径上取菌，接种到液体培养基中,每瓶3个菌块儿。将接种好的液体培养基封好封口膜，静置24 h后放入恒温培养箱中，以25 ℃，150 r·min-1，避光培养10 d。

2.3 菌球数量及干质量的测定

分别在每种液体培养基中取出100 mL菌液，计算菌丝球的数量。重复3次取平均值。

将菌丝培养液3 000 r·min-1离心10 min，弃上清液，向沉淀中加入等体积蒸馏水，摇匀后3 000 r·min-1离心10 min，重复3次。将分离出的菌丝放入50 ℃的恒温鼓风干燥箱内烘干至恒质量，用电子天平称质量。

2.4 葡萄糖标准曲线的绘制

将葡萄糖标准品置于100 ℃的烘箱内烘干至恒质量，准确称取葡萄糖纯品100 mg，加蒸馏水溶解后加入5 mL盐酸，定容至1 000 mL容量瓶中，得到葡萄糖标准液。精密吸取葡萄糖标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL，分别置于试管中，分别加入蒸馏水补至2 mL，依次加入6%的苯酚溶液1 mL和浓硫酸5 mL。室温放置10 min，冷却后用分光光度计在490 nm处测定吸光度，用蒸馏水做对照。以葡萄糖浓度为横坐标对吸光度值回归，求得标准曲线的回归方程。

2.5 胞内粗多糖含量的测定

胞内粗多糖的提取：将烘干至恒质量的羊肚菌菌丝研磨成细粉，过200目筛备用。称取羊肚菌菌丝1 g，置于离心管中，加入30倍体积的蒸馏水摇匀，放入超声仪器中50 ℃超声30 min。超声后立即以5 000 r·min-1离心10 min，收集上清液，重复3次，旋转蒸发浓缩至10 mL，加入40 mL无水乙醇震荡摇匀，然后置于4 ℃下沉淀12 h，沉淀后放入离心机5 000 r·min-1离心5 min，收集沉淀，用丙酮洗涤后将沉淀物置于50 ℃的烘箱中烘干至恒质量，即得羊肚菌粗多糖，将得到的粗多糖定容至1 L。羊肚菌胞内粗多糖含量的测量方法同2.4，计算羊肚菌多糖的含量。用公式y=m/M×100%，得出胞内多糖得率，式中：y-羊肚菌胞内多糖得率(%)；m-胞内多糖质量(g)；M-菌丝体的质量(g)。

3 试验结果

3.1 葡萄糖标准曲线

根据吸光度值绘制出来葡萄糖标准曲线，标准曲线表现出了很好的线性关系，图中横坐标为多糖的浓度(mg·mL-1)，纵坐标为吸光度(A)，得标准曲线回归方程y=15.885 x+0.010 4，R2=0.998 5。

图1 葡萄糖标准曲线

3.2 不同液体培养基对羊肚菌菌球生长的影响

根据表1所示，不同培养基配方的100 mL培养基中菌球个数的比较结果为Y4>Y3>Y1>Y2>Y5;菌丝干质量的比较结果为Y4>Y3>Y2>Y1>Y5。可见，无论是菌球个数还是菌丝的质量，Y4培养基都是最利于菌球生长的液体培养基，Y4培养基中菌丝球的个数为95个·(100 mL)-1，菌丝干质量为10.24 g·L-1，菌丝个数是Y5培养基的10.6倍，菌丝干质量是Y5培养基的5.6倍。

表1 不同液体培养基对羊肚菌菌球生长的影响

3.3 不同液体培养基对羊肚菌菌丝粗多糖得率的影响

由表2可知，不同培养基的多糖得率从大到小分别是Y4、Y3、Y2、Y5、Y1。Y4培养基的粗多糖得率最高为11.45%，是粗多糖得率最低的Y1培养基的5倍。

表2 不同液体培养基对羊肚菌菌丝粗多糖含量的影响

试验表明Y4培养基无论从菌丝生物量还是多糖得率方面均是最高的，且又是显著。

4 结果与讨论

本试验以5种不同的液体培养基配方(Y1：麦麸、黄豆粉；Y2：马铃薯黄豆粉；Y3马铃薯、酵母膏；Y4麦麸、酵母膏；Y5米糠、黄豆粉)对羊肚菌进行液体培养，试验表明，Y4培养基中菌球大小均匀、个数多，菌丝生物量最大，菌丝粗多糖得率最高。有研究表明，麦麸中含有丰富的氨基酸、维生素E、维生素B族和胡萝卜素等[14]，以麦麸、酵母膏为培养基质，为羊肚菌提供了优质丰富的碳氮源，这些碳氮源可以被羊肚菌菌丝体直接利用[15]。因此，本研究用麦麸、酵母膏培养液体羊肚菌可得到较多的菌球，菌丝的生长量也高。

[1] Jacquetant E.Les Morilles.La Bibliotheque des Arts Pairs[M].LBDA，1984

[2] Fu L H，Wang Y P，Wang J J，et a1.Evaluation of the antioxidant activity of extracellular polysaccharides from morchellaesculenta[J].Food&function，2013，4(6):871-879

[3] 熊亚，李敏杰.羊肚菌菌丝体基础培养基的优化[J].中国酿造，2013，32(5)： 114-118

[4] 赵琪，康平德，戚淑威，等.羊肚菌资源现状及可持续利用对策[J].西南农业学报，2010，23 (1):266-269

[5] 朱永真，杜双田，车进等.无机盐及生长因子对羊肚菌菌丝生长的影响[J].西北农业大学学报，2011，39(4)：211-215

[6] 刘蓓，吴素蕊，朱萍.滇西北地区四种羊肚菌营养成分分析比较[J].食品工业科技，2012，33(1):363-365

[7] 李娟，王臻，姚良同.羊肚菌多糖研究进展[J].微生物学杂志，2005, 25(4)：89-91

[8] Duncan C J G，Pugh N，Pasco D S，et al.Isolation of a galactomannan that enhances macrophage activation from the edible fungus morchella esculenta[J].Journal of agricultural and food chemistry，2002，50(20):5683-5685

[9] 李华，包海鹰，李玉.羊肚菌研究进展[J].菌物研究，2005, 2(4):53-60

[10] 孙晓明，张卫明.羊肚菌抗疲劳作用研究[J].中国野生植物资源，2001(1)：17-18,32

[11] 孙玉军，陈彦，周正义，等.羊肚菌胞内多糖对小鼠急性肝损伤的影响[J].中国食用菌杂志，2008，27(2)：41-42

[12] Nitha B, Janardhanan K K. Aqueous-ethanolic extract of morel mushroom mycelium Morchella esculenta, protects cisplatin and gentamicin induced nephrotoxicity in mice[J].Food and Chemical Toxicology，2008，46(9):3193-3199

[13] 殷伟伟，张松，吴金凤.尖顶羊肚菌活性提取物降血脂作用的研究[J].菌物学报，2009，28(6):873-877

[14] 贾天广，刘邦迪，郭亚辉. 麦麸的功能成分及其应用研究进展[J].食品研究与开发，2014,35(7)：122-126

[15] 张松.食用菌学[M].广州:华南理工大学出版社，2000:23-216

Selection of Liquid Culture Medium ofMorehellaesculenta

Cheng Yuan

(Baolongdian Seed Forest Farm,Wuchang City,Harbin 150200,China)

Morehellaesculentawas conducted liquid culture by five different liquid culture recipes (Y1: wheat bran, soybean powder; Y2: potato, soybean powder; Y3: potato, yeast extract; Y4: wheat bran, yeast extract; Y5: rice bran, soybean powder).Result shows that size of bacteria in Y4 medium is uniform, the number is 95·(100 mL)-1, the biomass of mycelial is 10.24 g·L-1, the highest rate of mycelial polysaccharide is 11.45%, indicating that the medium of wheat bran and yeast extract are the optimal medium among five kinds of medium.

Morehellaesculenta; liquid culture medium; selection

1005-5215(2017)08-0048-03

2017-05-25

程远(1982-)，男，黑龙江巴彦人，大学，工程师，从事小浆果及食用菌等培养研究.

S723.132.6

A

10.13601/j.issn.1005-5215.2017.07.015