活化T细胞核因子与肿瘤关系的研究进展

王建，柴嘉穗，张雅敏（.天津市第一中心医院移植中心肝胆外科，天津市器官移植重点实验室，天津市器官移植临床医学研究中心，天津 3009；.天津医科大学一中心临床学院，天津 3009）

活化T细胞核因子（nuclear factor of activated T cells，NFAT）最初在活化T细胞核提取物中被发现，是一种转录激活因子，可结合白细胞介素-2（interleukin-2，IL-2）启动子激活T细胞［1］。后来发现NFAT广泛表达于多种哺乳动物免疫细胞与组织细胞，是具有转录活性，多向调节功能的转录因子［2］。近年来，研究发现NFAT与肿瘤的形成、浸润、转移密切相关，在调节肿瘤细胞转化与生长、肿瘤血管生成等方面发挥重要作用。

1 NFAT的结构

NFAT家族的5个成员包括NFAT1（NFATc2/NFATp）、 NFAT2（NFATc1/NFATC）、 NFAT3（NFATc4）、NFAT4（NFATc3/NFATx）和NFAT5（TonEBP/OREBP）。NFAT5因高渗透压而活化［3］，NFAT1-4受 Ca2+/钙调神经磷酸酶（calcineurin， CaN）信号通路调节［4］。NFAT氨基末端和羧基末端各有一个转录激活 结 构域（transactivation region， TAD），NFAT1-4有与TAD串联的2个保守结构域（图1）：调节结构域，也称为NFAT同源区（NFAT-homology region，NHR），是与Ca2+结合的调节结构域；DNA结合结构域（DNA-binding domain， DBD），也称为Rel同源区［2］。Ca2+/CaN 信号通路调节 NFAT1-4［4］。NFAT5缺乏NHR结构域，不能被CaN激活［3］。本文主要对Ca2+/CaN/NFAT信号通路与肿瘤的关系进行概述。

图1 NFAT的主要结构

2 NFAT的调控机制

NHR在静息状态下高度磷酸化，保持NFAT在无活性状态并局限于细胞质。当细胞外配体与胞膜表面受体结合，如T细胞受体（T cell receptor，TCR）、酪氨酸激酶受体（receptor tyrosine kinase，RTK）或G蛋白偶联受体（G-protein-coupled receptor， GPCR），诱导磷脂酶Cγ（PLCγ）激活，随后将4，5-二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）被水解为甘油二酯（DAG）和三磷酸肌醇（IP3），IP3结合内质网膜上Ca2+通透性IP3受体（IP3R），刺激Ca2+从贮存池释放到细胞质，贮存池Ca2+的消耗导致基质相互作用分子（stromal interaction molecule，STIM） 的激活，促进血浆中钙释放激活通道（calcium release-activated calcium， CRAC）的开放，引起下游细胞内Ca2+水平的持续升高。胞质内Ca2+增加导致钙敏感钙调蛋白（Ca2+sensor calmodulin，CaM）激活，CaM进一步激活CaN。CaN水解NFAT使NHR的多磷酸残基去磷酸化，NFAT核定位序列（nuclear localization sequence， NLS）暴露，导致其易位入核，在细胞核内NFAT与Fos、Jun等其他转录因子协同，启动靶基因的转录［5］。而NHR的磷酸化使NFAT出核序列暴露和NLS遮盖，导致NFAT易位到细胞质。这种可逆的磷酸化控制NFAT在细胞核和细胞质间穿梭，切换其转录活性。

CaN在NFAT去磷酸化中具有关键的作用，CaN抑制剂可以有效促进NFAT出核，停留在细胞质。环孢素A（CsA）和他克莫司（FK506）可以抑制CaN，作为免疫抑制剂广泛应用于临床。此外，还有一些内源性CaN抑制剂如蛋白激酶A前体蛋白79、CaN结合蛋白1和唐氏综合征的候选区域1（Down's syndrome candidate region 1， DSCR 1）［6］。DSCR1通过抑制CaN通路而抑制肿瘤生长，这可能是唐氏综合征患者不易患恶性肿瘤的原因［7］。

除了CaN，还有多种激酶可以通过磷酸化NFAT蛋白调控其核穿梭。NFAT的磷酸化激酶根据作用方式可分为两类，一类在静止细胞的胞质中使NFAT蛋白保持磷酸化状态而阻止其进入细胞核，另一类在T细胞活化和CaN活性下降时于胞核中使NFAT蛋白磷酸化促进其出核。酪蛋白激酶1（casein kinase 1， CK1）磷酸化 NFAT的 SRR1调节区使其出核并停留在胞质内，糖原合成酶激酶3（GSK3）磷酸化NFAT1 的SP2调节区与NFAT2的SP2/3调节区促进其出核［8］。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase， MAPK）在人类肿瘤中过度激活，促进NFAT易位于细胞质，其中p38丝裂酶原活化蛋白（mitogen-activated protein，MAP）激酶磷酸化NFAT3中NHR丝氨酸残基，Jun氨基末端激酶（JNK）磷酸化NFAT2和NFAT4中 CaN 的结合区［2］。

此外，还有其他一些调节NFAT的分子机制。原癌基因Cot/Tpl2激酶和蛋白激酶C（protein kinase C， PKC）通路通过磷酸化NFAT1中TAD末端丝氨酸残基促进其核易位。CsA无法抑制这种转录激活，NFAT1可以不依赖CaN而被激活［9］。翻译后修饰，包括泛素化和泛素化修饰也可以调节NFAT［10］，这提示NFAT的调控网络错综复杂（图 2）。

3 NFAT与肿瘤的发生发展

NFAT在调节细胞周期、基因表达和凋亡中具有重要作用［2］，Ca2+/CaN/NFAT信号通路是维持正常的细胞生理功能所必需的，该通路的失调可能导致参与细胞恶性转化相关基因的表达，最终发生肿瘤。

图2 NFAT信号通路

研究发现，NFAT拮抗剂FK506对肝癌肿瘤细胞增殖具有抑制作用，FK506对周期蛋白（Cyclin A）表达的影响呈浓度负相关性，NFAT可能通过Cyclin A对肝癌细胞的增殖起抑制作用［11］。免疫组化分析发现，胰腺癌NFAT2与CaN的表达明显增高，正常或炎性胰腺组织低或无表达，CaN抑制剂或用siRNA敲除NFAT2可以抑制胰腺癌细胞增殖。NFAT2可以与胰腺癌细胞中的癌基因c-myc启动子结合，上调c-Myc转录引起cyclin D的表达，从而促进癌细胞的增殖［12］。NFAT2和c-myc的活化还可以作用于转化生长因子β（transforming growth factor-β， TGF-β），使其由早期癌的抑制因子转化为进展期癌的启动因子［13］。膀胱癌、非小细胞肺癌、肝癌、前列腺的肿瘤组织中也发现了NFAT2的过表达［6］。在胰腺癌中，NFAT2驱动上皮-间质转化（epithelial to mesenchymal transition，EMT），可能是干细胞特征的出现的根源［14］，在干细胞从休眠到增殖的转化中起关键作用。作为骨形态发生蛋白4的下游转录因子，NFAT2抑制周期蛋白依赖性激酶4（cyclin-dependent kinase 4，CDK4）从而维持干细胞的稳定，研究表明NFAT2的激活导致CD34细胞显著增殖，从而引发皮肤鳞状细胞癌［15］。

NFAT1可以抑制CDK4和细胞周期蛋白A2表达，从而控制细胞周期活动和增殖，NFAT1缺陷小鼠对化学致癌物刺激更易发生肿瘤［16］，这提示NFAT1具有肿瘤抑制作用。乳腺浸润性导管癌高表达NFAT1和NFAT4，NFAT1可诱导癌基因mdm2转录，使抑癌基因P53失活，晚期胰腺癌NFAT1的高表达与使抑癌基因p15沉默相关，有研究发现NFAT1在启动和促进炎症相关的结肠直肠肿瘤中起关键作用，对黑色素瘤细胞的去分化起促进作用［2，17］。这又提示NFAT1有促癌作用。可能NFAT1在未转化细胞是抑癌基因，但在肿瘤细胞转变为癌基因。NFAT3可诱导腺泡对导管去分化，与胰腺癌发生相关［18］。在肿瘤形成与发展过程中，NFAT因组织细胞特异性导致不同蛋白水平、不同亚型的表达以及伴侣蛋白表达的改变，由此引起的信号转导通路变化是肿瘤发生的关键。

4 NFAT与肿瘤转移

转移性是肿瘤的基本特征和和重要标志。血管生成和淋巴管生成是肿瘤转移必需的，肿瘤细胞通过EMT变得具有攻击性和活动性，并侵入血管或淋巴管进入循环。越来越多的证据显示，NFAT在肿瘤转移过程中发挥重要作用。

4.1 NFAT与肿瘤血管和淋巴管生成：Ca2+/CaN/NFAT信号通路对脊椎动物的心血管系统形成是必不可少的。已经确认与肿瘤血管生成有关的细胞因子有血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A， VEGFA）、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor， FGF）和分泌型卷曲相关蛋白2（SFRP 2）等［19-20］。VEGFA结合VEGF受体（VEGFR）激活PLCγ，而FGF23结合FGF受体1c（FGR1c），二者引起Ca2+/CaN/NFAT信号通路激活。SFRP2通过非经典Wnt/Ca2+/ NFAT通路促进NFAT4核易位。易位到核内后，NFAT增强参与血管生成的靶基因的转录，如环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）、 组 织 因 子（tissue factor，TF）等。唐氏综合征患者内源性CaN抑制剂DSCR1和NFAT维持激酶DYRK1A上调，不易患恶性肿瘤。利用转基因小鼠，研究发现，DSCR1和DYRK1A通过阻断VEGFA/Ca2+/CaN/NFAT信号通路抑制血管生成［21］。

VEGF和血小板源性生长因子（platelet-derived growth factor BB， PDGF-BB）是肿瘤转移和淋巴管生成的重要分子，通过VEGF/NFAT1和PDGF/NFAT1途径促进淋巴管生成和淋巴结转移［22］。免疫组化发现淋巴结转移的非小细胞肺癌患者NFAT1表达明显增高［23］，PDGF-BB和VEGF-C的高表达与非小细胞肺癌淋巴管生成和预后不良相关［22］。VEGF在肿瘤血管生成拟态（vasculogenic mimicry，VM）形成中起着重要的作用［24］，NFAT有可能通过VEGF参与肿瘤（vasculogenic mimicry，VM）的形成，这需要进一步研究来证实。

4.2 NFAT与肿瘤的侵袭和转移：NFAT1和NFAT5在浸润性导管乳腺癌的组织切片中高表达，它们是整合素α6β4的下游基因。整合素参与肿瘤细胞的增殖、生存和凋亡等多个环节的调节，通过α6β4整联蛋白的信号传导和激活NFAT5，可能与肿瘤细胞转移有关［25］。与此一致，蛋白激酶B（PKB）依赖性NFAT1泛素化及其随后的降解蛋白酶体导致乳腺癌细胞系的迁移和侵袭潜能减弱［26］。NFAT是侵袭和转移相关基因如COX-2和自家趋化素（autotaxin，ATX）的转录因子。乳腺上皮细胞NFAT1诱导COX-2表达，催化PGE 2的合成。敲除或用药物抑制COX-2可限制乳腺癌细胞的侵袭，相反COX-2和PGE2的过表达促进细胞侵袭［27］。ATX可以将溶血磷脂胆碱转化成溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid，LPA），LPA是乳腺癌的有丝分裂原和运动因子。ATX通过α6β4/NFAT依赖的方式过表达，促进乳腺癌细胞转移［28］。三阴性乳腺癌NFAT1和NFAT2的表达明显增高，体外及体内实验进一步证实Ca2+/CaN/NFAT信号通路的激活参与调节乳腺癌细胞的侵袭和转移［29］。

NFAT1可以促进6-磷脂酰肌醇聚糖 （glypican-6，GPC-6）转录，后者通过Wnt5a信号激活JNK和p38 MAPK，促进乳腺癌细胞的侵袭性转移［30］。p38 MAPK是NFAT1的出核激酶，这可能是NFAT的一个自反馈机制。在乳腺癌细胞中CK1ε突变可以抑制Wnt/β联蛋白，激活Wnt/Rac1/JNK和NFAT通路，降低癌细胞的黏附性，促进肿瘤的转移［31］。

5 NFAT与肿瘤微环境

肿瘤微环境是一个由内皮细胞、成纤维细胞、周细胞、肌肉细胞、免疫细胞以及细胞外基质组成的复杂系统。它是肿瘤不可或缺的重要组成部分，参与肿瘤的各个阶段，包括肿瘤发生、肿瘤增殖、转移和耐药。肿瘤细胞NFAT信号激活导致产生炎症趋化因子，促进炎症细胞，包括肥大细胞，嗜中性粒细胞和单核细胞的浸润。巨噬细胞浸润到肿瘤微环境，分泌表皮生长因子（epidermal growth factor， EGF）和集落刺激因子1（colony stimulating factor 1， CSF1），NFAT也可以诱导免疫细胞和肿瘤细胞分泌CSF1，促进肿瘤的增殖和迁移［6］。NFAT2转基因小鼠容易出现皮肤和卵巢肿瘤。在皮肤与卵巢肿瘤中，高表达和周围低表达NFAT2细胞c-myc、信号转录与转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3， STAT3）都上调，这表明NFAT2的活化可以影响微环境，在原位建立肿瘤微环境，进一步影响到周围的细胞。CaN抑制剂DSCR1的缺失，导致肺血管内皮细胞Ca2+/CaN/NFAT/促血管生成素-2 （angiopoietin-2，Ang-2）通路的过量激活，促进预转移微血管生成，形成肺转移［32］。

6 NFAT与肿瘤的治疗

越来越多的证据表明，NFAT家族参与化疗和靶向药物的耐药。伊马替尼可以改善费城染色体阳性（Ph+）慢性粒细胞白血病（chronic myelogenous leukemia， CML）患者的预后，但肿瘤经常会出现耐药并变得更有侵袭性。研究表明，Wnt/Ca2+/NFAT通路介导CML细胞对伊马替尼的耐药，Wnt/Ca2+/NFAT信号通路的阻断可以提高Ph+的CML细胞对伊马替尼的敏感性［33］。Wnt/Ca2+/NFAT通路也介导胰腺癌细胞耐受药物诱导的细胞凋亡，Wnt5A敲除可使吉西他滨诱导的细胞凋亡显著增加，NFAT1作为Wnt5a下游的目标，也通过抗凋亡机制起作用［34］。EGF受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）显着延长EGFR突变的非小细胞肺癌患者的总生存期，但耐药性的出现最终导致治疗失败。研究发现，STAT3通过Wnt/Ca2+/NFAT通路，介导癌细胞对 EGFR-TKI的耐药［35］。CsA 通过抑制STAT3可以增强EGFR-TKI对癌细胞的抗癌活性［36］。

钙调磷酸酶抑制剂CsA和FK506作为免疫抑制剂广泛应用于器官移植患者［37］。CsA与亲免蛋白亲环素结合，而FK506结合FK结合蛋白。两种药物-免疫亲和素复合物与CaN直接作用，抑制其磷酸酶活性，导致NFAT失活。这会导致广泛的NFAT抑制，NFAT抑制剂临床应用常伴随各种毒副作用。肿瘤特异性或NFAT亚型特异性抑制剂可能是一种更有效的肿瘤治疗方法，已有报道多种化合物和药物有此功能，在不同类型的肿瘤都具有很好的抗肿瘤作用，如唑来膦酸、洋地黄和异黄酮［6］。内源性CaN抑制剂DCSR1也可以作为治疗的靶点［21］，NFAT的靶基因，如COX-2、VEGF和IL，也可以作为治疗的靶点。另一方面，利用NFAT抑制剂联合抗癌药物来克服肿瘤耐药也是很有前景的方法。达沙替尼联合CsA治疗慢性粒细胞白血病的临床试验（NCT01426334）正在进行中。

7 总 结

NFAT在肿瘤发生、增殖、转移、耐药和肿瘤微环境中起重要作用。免疫和炎症是肿瘤发生、发展的重要组成部分，NFAT处于二者的交叉点，如何在免疫和肿瘤之间取得平衡可能是关键所在。目前尚不清楚NFAT不同亚型在不同肿瘤中的作用相反的机制以及NFAT特定亚型的功能。在肿瘤细胞中，编码NFAT的基因是否存在突变或扩增，调节NFAT的激酶或结合NFAT的配体是否存在功能失调尚不明确。找到这些重要问题的答案，进一步理解NFAT在肿瘤中的作用，有助于将NFAT通路作为肿瘤治疗的靶点。