间充质干细胞体外修复DCD供肝的研究

尹明丽，史源，杨洋，郑卫萍，沈中阳，宋红丽（.天津医科大学一中心临床学院，天津 3009；.天津市第一中心医院器官移植科，天津市器官移植重点实验室，天津3009）

随着肝移植技术的发展成熟和抗排斥药物的不断更新，肝移植已经成为各种终末期肝病患者最有效的治疗方法［1］。由于需要接受肝移植患者的不断增加，供肝的短缺问题日渐显著［2］。为了解决供肝短缺问题，心脏死亡器官捐献（donation after cardiac death，DCD）肝脏已成为我国肝移植的重要来源［3］。DCD供体可以扩大供体池［4］，同时边缘性供肝作为扩大供肝来源的办法已越来越受到重视［5］。

DCD供肝存在热缺血时间长、移植物损伤严重和术后受体生存时间短等问题。缺血/再灌注是导致DCD供肝功能损伤的重要原因，目前尚缺乏有效的治疗手段［6］。研究发现，使用机械灌注的方法保存供肝能够减少供肝的缺血/再灌注损伤（ishemia reperfusion injury，IRI），从而改善肝移植的效果［7］，而常温机械灌注（normothermic mechanical perfusion，NMP）能够提供更多的氧和营养物质，从而改善边缘供肝移植术后的效果［8］。肝窦内皮细胞在缺血/再灌注的早期即可出现结构及功能的损害［9］，但NMP并不能修复肝窦内皮细胞等的损伤，因此，还需要增加一种方法在进行NMP的同时对肝脏进行修复。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs）对IRI的肝脏具有明确的保护和修复的作用［10］。本研究在NMP系统的基础上，引进BMMSCs，研究其在NMP下对DCD肝脏的影响结果。

1 材料和方法

1.1 BMMSCs的获取：无菌提取BMMSCs，培养到第3代，进行检测［11］。

1.2 实验动物及分组：2～3周体重为40～60 g的健康雄性Wistar大鼠用于提取BMMSCs，5～8周体重为180～200 g健康的雄性Wistar大鼠用于DCD模型的建立。所有动物均由军事医学科学院实验动物中心提供，标准鼠食喂养。所有实验动物操作均遵循实验动物伦理条例，并由天津市第一中心医院伦理委员会批准进行。实验分组：随机分成3组，A组为冷保存组（n＝5）、B组为单纯NMP组（n＝5）、C组为NMP＋BMMSCs组（n＝5）。

1.3 动物模型的建立：取Wistar大鼠，单笼饲养，禁食12小时以上。腹腔麻醉后，充分暴露肝脏，下腔静脉注射0.4 ml（400 U）的肝素生理盐水［12］，除去肝周围不用的组织，分离出门静脉、下腔静脉及胆总管，夹闭胸主动脉，计时45分钟。结束时快速进行门静脉、下腔静脉以及胆总管的插管。B组采用UW液进行冷保存，另两组进行机械灌注，C组在进行NMP前在器官室内从门静脉注射 BMMSCs 1ml（5×106个 /ml）。门静脉连接到膜肺的动脉出口，下腔静脉连接到膜肺的静脉入口。门脉压力灌注压力一般控制在5～8 mmHg（1 mmHg＝0.133 kPa）［8］，本实验灌注压力控制在5.5 mmHg监护仪持续监控，灌注速度为4 ml/min。灌注液是含有10%FBS的DMEM-F12培养液、1%双抗混合液以及5%的自体全血。

1.4 血生化仪检测血清肝功能酶的变化情况：出口阀抽取灌注液进行肝功能酶丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase， ALT）和天冬氨酸转氨酶（aspertate aminotransferase，AST）的分析，同时抽取A组肝下下腔静脉的保存液进行分析。

1.5 血气分析仪检测灌注液血气的变化情况：灌注过程中每小时从入口阀和出口阀抽取灌注液进行血气分析，观察各项指标。通过分析血气检测结果，计算灌注过程中肝脏的耗氧量。

1.6 组织形态学观察肝脏的情况：观察各组肝脏的外观情况。每组样本取自左外侧叶，浸在4%的甲醛溶液中，制成组织切片进行苏木精-伊红（hematoxylin-eosin， HE）染色，光学显微镜下观察。

1.7 统计学分析：采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析，数据以均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 BMMSCs的检测情况：培养BMMSCs到原代（图1a）和3代（图1b）分别拍照观察细胞状态，流式细胞术测得细胞表面标记表达率，检测显示第 3代 Wistar大 鼠 BMMSCs CD29、CD90、RT1A表达的阳性率分别为96.7%、95.5%和95.0%；而CD34、CD45、RT1B均为阴性，阴性率均＞95%（图1），体外获得的细胞是BMMSCs。

图1 BMMSCs细胞生长状态（a、b）和流式检测结果（c、d、e）

2.2 各组ALT和AST的情况（图2）：三组在机械灌注/冷保存前处于相同的状态，ALT和AST之间无明显的差异。实验后4小时发现B组ALT和AST水平明显低于A组（均P＜0.05；）；C组ALT和AST水平明显低于B组（均P＜0.05）；C组明显低于A组（均P＜0.05）。NMP联合BMMSCs的修复作用明显优于单纯NMP和冷保存的作用。

图2 各组丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶

2.3 B组和C组在灌注过程中耗氧量的变化情况比较（图3）：两组开始灌注时耗氧量快速增加，灌注0小时和1小时两组之间没有差异（均P＞0.05）；灌注的第2小时C组明显高于B组（P＜0.05）；在灌注3小时和4小时耗氧量增加减慢，但C组仍明显明高于B组（均P＜0.05）。NMP联合BMMSCs能够更好地修复DCD肝脏，使更多的肝细胞恢复活性。

图3 灌注组耗氧量的变化情况

图4 各组肝脏汇管区组织学的情况（HE染色 低倍放大）

2.4 肝脏组织学（图4）：肝脏热缺血45分钟后肝脏出现严重的损伤，肝窦淤血扩张、小叶间动静脉和小叶间胆管有明显的扩张，部分肝细胞有空泡样改变、点状坏死和灶状坏死（图4b）。A组热缺血4小时肝脏损伤加重，肝窦缩窄、小叶间动静脉和小叶间胆管官腔明显缩窄变形，汇管区塌陷，肝细胞空泡样变性加重（图4c）。B组热缺血4小时较A组肝窦、小叶间静脉明显扩张，汇管区明显改善（图4d）；且肝细胞肿胀程度较热缺血45分钟的肝脏明显降低。C组热缺血4小时肝窦、小叶间动静脉和小叶间胆管轻微扩张，汇管区已基本恢复正常，肝脏实质细胞仍有轻微的空泡样变（图4 e）；肝脏得到了明显的改善，且效果明显优于冷保存组和NMP组。

2.5 形态学的情况：正常大鼠肝脏色泽红润，呈鲜红色（图5a）。热缺血45分钟的肝脏出现严重的淤血（图5b），肝脏呈现暗红色，这也是缺血损伤的标志。灌注过程中肝脏色泽发生明显改变，C组4小时肝脏红润（图5e），B组4小时肝脏色泽变白（图5d）。C组肝脏的形态明显好于B组。而A组4小时肝脏色泽暗淡，表面出现花斑，明显次于灌注组的肝脏（图5c）。这提示NMP联合BMMSCs能更好修复DCD肝脏组织结构。

图5 各组肝脏形态学的情况

3 讨 论

肝移植是终末期肝病最有效的治疗方案［13］，由于供肝短缺，阻碍了肝移植事业的发展。随着临床DCD供肝的使用，使得供肝匮乏的问题在一定程度上得以解决，并且扩大了可移植器官的范围，使供体数量增加了10%～20%［14］，但DCD供肝存在IRI问题，致使发生原发性移植肝无功能及移植肝功能障碍的风险增加。IRI是由缺血的组织或器官重新恢复血流灌注而导致的组织结构、功能及代谢的变化，这些变化造成组织水肿、出血和坏死等。因此，减少DCD供肝的IRI至关重要，临床工作中应运用多种方式最大限度地降低DCD供肝IRI的发生，可以通过改善DCD供肝的获取途径、保存方式、微循环和减少DCD供肝的炎症反应等。目前，临床上常用的减少IRI损伤的方法主要有缺血预处理，药物治疗及器官保存方法的改进。缺血预处理和药物治疗只能在一定程度上缓解DCD供肝的IRI，并不能从根本上解决问题［15］。因此，找到一种新的器官保存方法进而改善DCD供肝的IRI是急需要解决的问题。BMMSCs是一类具有高度自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞［16］。BMMSCs可通过旁分泌或趋化富集于IRI受损器官，抗凋亡、促进血管生成、促进干细胞及祖细胞增殖分化、介导免疫调节、趋化到受损部位修复受损组织，从而发挥治疗作用［17］。本研究在NMP的同时加入BMMSCs，BMMSCs（从门静脉直接进入肝脏） 直接作用于肝脏，进而修复DCD供肝。

有研究显示，大鼠热缺血时间超过45分钟时，术后受体虽获得了短期的存活时间但生存时间很短，而热缺血60分钟时，供肝已发生不可逆转的损伤［18］。冷保存对DCD供肝的损伤严重，Mathur等［19］研究发现冷缺血时间每延长1小时，移植物功能障碍的发生率将增加6%，Mathur等［20］认为冷保存时间应＜4小时。NMP能够明显改善DCD供肝的微循环［20-21］，对于供肝细胞的复苏非常重要［22］。Xu等［7］的研究结果显示，经过4小时机械灌注肝脏得到了很大的修复，功能得到很好的改善。因此，我们通过预实验验证，最终选取热缺血45分钟做为本实验的DCD模型，灌注/冷保存4小时做为本实验的观察时间点，含有5%血清的细胞培养液做为循环液，进行实验观察实验效果。

冷保存4小时肝脏外观淤血呈暗红色、病理表现肝细胞水肿并严重坏死、ALT和AST含量持续增高，说明肝脏的损伤程度严重；采用单纯的NMP，4小时肝脏的淤血情况得到很好的改善，色泽变白，肝脏病理显示肝细胞水肿程度降低，ALT和AST水平降低；而NMP联合BMMSCs修复，4小时肝脏的外观色泽更红润光亮，病理表现中央静脉区和汇管区轻微异常，ALT和AST含量明显降低且显著低于NMP 4小时，说明NMP联合BMMSCs能够改善肝窦微循环和修复肝脏功能。 机械灌注两组耗氧量的比较也证实了这一点，NMP+BMMSCs组的耗氧量在1小时后均明显的高于NMP组，说明在同一灌注时间下，NMP联合BMMSCs能够使更多的肝脏细胞得到修复，使更多的肝脏细胞恢复活性。

含氧血液做为灌注液进行NMP可以显著改善DCD供肝的功能［23］。为了更好地修复DCD供肝，循环液的成分需要进一步的改进。同时修复时间也有待进一步延长和优化。DCD供肝后的IRI目前缺乏有效的针对性治疗手段，BMMSCs在其中的应用拓展了细胞治疗的应用范围，并为更多的DCD供肝应用于临床提供了可能的治疗手段。

总之，本研究显示常温机械灌注能够修复DCD热缺血45分钟的肝脏，常温机械灌注联合BMMSCs能够更好地修复受损的肝脏，这将为如何更好地修复DCD供肝并应用于临床提供新的重要思路。