表皮干细胞复合羊膜构建组织工程皮肤修复糖尿病难愈创面的可行性分析

狄海萍 李晓亮 薛继东 李强 曹大勇 韩大伟 夏成德(郑州市第一人民医院 烧伤中心 河南 郑州 450000)

表皮干细胞复合羊膜构建组织工程皮肤修复糖尿病难愈创面的可行性分析

狄海萍 李晓亮 薛继东 李强 曹大勇 韩大伟 夏成德
(郑州市第一人民医院 烧伤中心 河南 郑州 450000)

目的 对表皮干细胞复合羊膜构建组织工程皮肤修复糖尿病难愈创面的可行性进行分析和探讨。方法 选取60只体质量250～300 g的雄性SD大鼠，建立糖尿病SD大鼠创面模型，分离培养大鼠皮肤表皮干细胞(ESCs)，使用5-溴脱氧尿嘧啶(5-BrdU)对其进行标记。使用随机数表法将大鼠分为A、B、C组，A组大鼠皮肤创面接受羊膜负载BrdU标记的ESCs组织工程皮肤移植；B组大鼠皮肤创面接受羊膜移植；C组大鼠皮肤创面不接受处理。观察3组大鼠皮肤创面的愈合情况。结果 A组大鼠治疗7、14 d后的PCNA阳性细胞积分光密度平均值以及创面愈合率均高于B、C组，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 表皮干细胞复合羊膜构建组织工程皮肤修复糖尿病难愈创面安全可行。

表皮干细胞；羊膜；糖尿病；难愈创面

现今我国糖尿病患者发病人数逐年递增，预计2025年糖尿病患者人数将达6 000万。因血管和神经发生病变，糖尿病患者极易出现溃疡，不断扩大，且糖尿病患者后期生活中可能会遭遇不同程度的事故而需要接受手术治疗，以上因素均会造成程度不同的“难愈创面”。糖尿病创面难愈为目前常见的临床难题，本研究以60只雄性SD大鼠为对象，分析探讨表皮干细胞复合羊膜构建组织工程皮肤修复糖尿病难愈创面的可行性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取60只体质量250～300 g的雄性SD大鼠作为本次研究对象，大鼠是由南昌大学试验动物科学部提供，实验过程中所有对大鼠进行的操作与处置均符合动物伦理学的相关标准。研究所用材料如下：美国K19抗体；Sigma Ⅳ型胶原；链脲佐菌素(streptozocin，STZ)；5-BrdU(Adooq Bioscience)；β1整合素(英国abcam)；BrdU抗体(中国北京中杉金桥公司)；胰蛋白酶-EDTA(美国Gibco公司)；角质细胞无血清培养基、胎牛血清。

1.2 方法 随机抽取40只大鼠建立糖尿病模型，剩下20只行表皮干细胞分离培养。糖尿病模型建立方法如下：禁食16 h以上，对禁食完毕的大鼠体质量进行测量[1]；抽取大鼠尾部空腹静脉血，测定血糖浓度；将0.1 mol的pH 4.5柠檬酸钠缓冲液加入STZ与柠檬酸的混合液中，摇匀配制成注射液；过滤除菌处理后对大鼠进行一次性腹腔注射，65 mg/kg；注射72 h后，使用稳步血糖测定仪对大鼠随机体质量、血糖、毛发颜色变化等进行检测；每周测量1次大鼠血糖，若大鼠在连续3次的血糖检测中，血糖值均≥16.7 mmol/L，同时临床表现出消瘦、多饮、多食、多尿的“一少三多”症状，则认为该大鼠为DM大鼠[2]。

表皮干细胞的分离培养方法：无菌条件下剥离大鼠全层背部皮肤；刀片彻底清除皮肤结缔组织与皮下组织，漂洗；将皮片剪成面积为0.3 cm×0.5 cm的大小，置入培养瓶；培养瓶内加入0.02%浓度的EDTA以及0.25%浓度的胰蛋白酶，体积比为5∶1；4 ℃冰箱中保存、消化过夜；磷酸盐缓冲液稀释Ⅳ型胶原，并将稀释后的液体培养板上均匀涂抹，风干备用；取出皮条片并将适量的胎牛血清滴于其上[3]；200目筛网过滤表皮层，1 000 r/min的速度离心5 min，分离血清，制成细胞悬液；培养20 min后取出，加入10%的胎牛血清以及10 μg/L的表皮生长因子，37 ℃恒温培养箱中培养；细胞70%～80%融合后，以1∶3的比例传代；细胞β1整合素以及K19接受免疫细胞化学法的检测，若均呈现阳性，则鉴定为ESCs[4]。皮肤创面的修复：A组大鼠行经体外培养扩增、羊膜负载、ESCs组织工程皮肤移植的修复；B组大鼠行羊膜修复；C组大鼠创面不接受任何干预。

1.3 观察指标 观察大鼠皮肤创面愈合情况，计算大鼠皮肤创面的愈合面积，皮肤愈合面积百分率=(皮肤创面初始面积-治疗后皮肤愈合面积)/皮肤创面初始面积×100%。400倍光学显微镜下观察HE染色切片等，大鼠阳性细胞积分光密度的平均值采用Image-proplus 6.0软件测量。

2 结果

2.1 皮肤创面愈合情况 治疗7、14 d后，A组大鼠皮肤创面愈合率均明显高于B、C组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 3组大鼠治疗7、14 d后皮肤创面愈合情况比较

注：与B、C组比较，aP<0.05。

2.2 PCNA阳性细胞积分光密度平均值 A组大鼠治疗7、14 d后的PCNA阳性细胞积分光密度平均值与B、C组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 3组大鼠治疗7、14 d后PCNA阳性细胞积分光密度平均值比较

注：与B、C组比较，bP<0.05。

3 讨论

羊膜位于胎盘最内层，为具有一定弹性的半透明薄膜，结构与人眼结膜组织相似，其内包含多种能够促进结膜细胞增殖、角膜上皮细胞生长的物质，早在100多年前便作为一种敷料广泛应用于外科的临床治疗中。多项研究证明羊膜为构建皮肤理想的组织工程支架材料，一方面能加速负载细胞的生长，有效控制炎症，促进溃疡愈合；一方面能诱导纤维血管组织长入，并可在机体新生皮肤生长成熟后自动降解，对人体几乎无不良影响[5]。

羊膜为半透明的薄膜，含有多种促进细胞增殖的营养成分，可为细胞的分化、增殖提供丰富营养，促进细胞生长和繁殖。表皮干细胞作为皮肤组织的特异性干细胞，有强大的增殖及多向分化的潜能，是皮肤组织发生、创面修复及改建的关键性细胞。在创面愈合过程中，创面的再上皮化依赖表皮细胞的增殖等生物学行为的正常发挥，从创面愈合过程中表皮干细胞动态变化来看，表皮干细胞数量少和活性低是导致糖尿病创面愈合延迟的重要原因。本研究中，接受因表皮干细胞复合羊膜构建组织工程皮肤修复的A组治疗7、14 d后的创面愈合率均显著高于接受羊膜移植的B组以及未接受任何处理的C组，差异有统计学意义(P<0.05)；此外，A组大鼠治疗7、14 d后PCNA阳性细胞积分光密度平均值亦明显高于B、C组，差异有统计学意义(P<0.05)。结果表明，表皮干细胞复合羊膜构建组织工程皮肤修复是提高糖尿病难愈创面治疗效果的有效途径，ESCs能够主动参与到糖尿病的创面修复过程中，有效发挥促上皮化作用，加速创面好转。

综上所述，表皮干细胞复合羊膜构建组织工程皮肤修复糖尿病难愈创面效果显著，安全可靠，具有高度可行性，值得临床进一步推广和使用。

[1] 刘德伍,钟清玲,刘繁荣,等.表皮干细胞复合羊膜构建组织工程皮肤修复糖尿病难愈创面[J].透析与人工器官,2010,21(3):12-14,46.

[2] 刘爱军,黄锦桃,李海标,等.ES细胞源性表皮干细胞与类真皮构建组织工程皮肤的体内分化[J].解剖学研究,2006,28(3):161-164,封二.

[3] 黄文琪,可金星,陶忠芬,等.扫描电镜在人羊膜负载猪骨髓间充质干细胞生长形态学研究中的应用[J].电子显微学报,2004,23(4):319.

[4] 聂刚,亓俊华,姜南雁,等.高浓度葡萄糖对小鼠表皮干细胞增殖的影响[J].医学研究杂志,2014,43(10):99-103.

[5] 陆树良,谢挺,牛轶雯,等.糖尿病合并创面难愈的机制研究[J].药品评价,2011,8(7):17-21.

Feasibility analysis of tissue engineering skin constructed by epidermal stem cells and amniotic membrane for the repair of diabetic refractory wound

Di Haiping, Li Xiaoliang, Xue Jidong, Li Qiang, Cao Dayong, Han Dawei, Xia Chengde
(BurnCenter,theFirstPeople’sHospitalofZhengzhou,Zhengzhou450000,China)

Objective To analyze the feasibility of tissue engineering skin constructed by epidermal stem cells and amniotic membrane for the repair of diabetic refractory wound. Methods A total of 60 male SD rats with body mass of 250 to 300 g were selected and established diabetic wound model. Rat skin epidermal stem cells (ESCs) were isolated and cultured, and labelled by 5- bromodeoxyuridine (5-BrdU). All the rats were divided into group A, B and C according to a random number table method. Group A

the transplantation of amniotic membrane-loaded and BrdU-labeled ESCs tissue engineering skin, Group B received amniotic membrane transplantation, and Group C did not accept the deal. The wound healing of 3 groups of rats was observed. Results The PCNA positive cells, integral optical density, mean value and wound healing rate of group A were higher than those in group B and C 7 and 14 d after treatment, and the differences were statistically significant (P<0.05). Conclusion Tissue engineering skin constructed by epidermal stem cells and amniotic membrane is feasible for the repair of diabetic refractory wound.

epidermal stem cell; amniotic membrane; diabetes; refractory wound

夏成德，E-mail：xcdeyxyj@126.com。

R 641

10.3969/j.issn.1004-437X.2017.16.009

2016-11-25)