润燥灵对干燥综合征模型小鼠免疫调节及抗炎作用研究

马武开+侯雷+曾苹+宁乔怡+姚血明+和秀丽+王莹

【摘 要】目的：探讨中药润燥灵方对干燥综合征模型小鼠免疫器官的影响及其抗炎作用。方法：将90只C57bl/6j小鼠随机分为空白对照组，模型对照组，醋酸泼尼松组和润燥灵高、中、低剂量组，每组15只。除空白对照组外，其余各组采用免疫诱导法建立干燥综合征小鼠模型，造模第5周开始灌胃给药。空白对照组、模型对照组均给予蒸馏水0.2 mL·d-1灌胃，醋酸泼尼松组给予醋酸泼尼松混悬液2 mg·kg-1·d-1灌胃，润燥灵高、中、低剂量组分别给予润燥灵50，25，12.5 g·kg-1·d-1灌胃。用药4周后眼球取血，乌拉坦麻醉后断颈处死小鼠，分离颌下腺、胸腺和脾脏，计算小鼠颌下腺、胸腺和脾脏指数，HE染色观察病理变化，ELISA法检测小鼠血清白细胞介素-17（IL-17）的分泌情况。结果：颌下腺指数研究结果显示，润燥灵高剂量组小鼠颌下腺指数较模型对照组明显增加（P ﹤ 0.05），与醋酸泼尼松组相当（P ﹥ 0.05）。胸腺和脾脏指数研究显示，与模型对照组比较，润燥灵高剂量组和醋酸泼尼松组均能明显降低干燥综合征小鼠胸腺和脾脏指数（P ﹤ 0.05或P ﹤ 0.01），而中、低剂量组影响不明显（P ﹥ 0.05）。病理结果研究显示，与模型对照组比较，润燥灵高剂量组能够明显改善干燥综合征小鼠颌下腺、胸腺和脏脾的病理变化，而中、低剂量组不明显。ELISA检测结果显示，模型对照组小鼠IL-17分泌量增加（P ﹤ 0.01）；与模型对照组比较，润燥灵高、中剂量组均能降低IL-17的分泌量

（P ﹤ 0.05），低剂量组降低不明显（P ﹥ 0.05）。结论：润燥灵具有降低干燥综合征模型小鼠颌下腺指数，下调IL-17分泌的作用。

【关键词】 干燥综合征；润燥灵；颌下腺；胸腺；脾臟；免疫器官；IL-17；小鼠

On the Immunoregulation and Anti-inflammation of Runzao Ling（润燥灵）on Model Mice

with Sj?gren's Syndrome

MA Wu-kai，HOU Lei，ZENG Ping，NING Qiao-yi，YAO Xue-ming，HE Xiu-li，WANG Ying

【ABSTRACT】Objective：To investigate the effects of Runzao Ling（润燥灵）on immune organs in mice with sj?gren's syndrome and its anti-inflammatory effects.Methods：Ninety C57bl/6j mice were randomly divided into a blank control group，a model control group，a prednisone acetate group and Runzao Ling groups （with high，medium and low doses），15 rats in each group.Except for the blank control group，the mice in other groups were induced by immune induction to establish the models with sj?gren's syndrome，and the models were given intragastric administration from the fifth week.The rice in the blank control group and the model control group were given intragastric administration of distilled water （0.2 mL·d-1）.The mice in the prednisone group were given intragastric administration of prednisone suspension （2 mg·kg-1·d-1）.The mice in the Runzao Ling groups （with high，medium and low doses） were given intragastric administration of Runzao Ling （50，25，12.5 g·kg-1·d-1 respectively）.After

4 weeks of treatment，the eye blood was taken and the urethane anesthetized mice were killed.The submandibular gland，thymus and spleen of the killed mice were separated to calculate their index.Their pathological changes were observed by HE staining and the ELISA method was used to detect the secretion of IL-17 in the serum.Results：The submandibular gland index in the high-dose Runzao Ling group were significantly higher than those in the model control group（P < 0.05），and were almost equivalent to those of the prednisone group（P > 0.05）.Compared with the model group，the high-dose Runzaoling group and the prednisone group could significantly reduce the index of thymus and spleen in mice with sj?gren's syndrome（P < 0.05 or P < 0.01），while there was no obvious effects in the medium and low dose groups（P > 0.05）.The pathological results showed that compared with the model control group，the high-dose Runzao Ling group could obviously improve the pathological changes of the submandibular gland，thymus and spleen in the mice with sj?gren's syndrome，but those in the middle and low dose groups are not obvious.ELISA test results showed that IL-17 secretion of mice in the model group increased （P < 0.01）.Compared with the model group，medium and high dose groups of Runzao Ling could reduce the secretion of IL-17（P < 0.05），while that in the low-dose group did not significantly decrease（P > 0.05）.Conclusion：Runzao Ling can reduce the submandibular gland index and down regulate the secretion of IL-17 in model mice with sj?gren's syndrome.

【Keywords】 sj?gren's syndrome；Runzao Ling（润燥灵）；submandibular gland；thymus；spleen；immune organ；IL-17；mice

干燥综合征（sj?gren's syndrome，SS）是一种以侵犯外分泌腺为主要病理特征的自身免疫性疾病，临床以口、眼干燥，关节疼痛及多系统损害为主。SS的发病机制尚不清楚，目前尚无特效治疗药物，临床多采用对症治疗改善口眼干燥为主。SS属中医学“燥证”“燥痹”范畴。SS患者大多数具有口眼干燥、皮肤皲裂等阴虚燥热之象，既往中医治疗常根据临床表现从滋阴润燥入手，但疗效并不理想。为此，笔者根据SS的发病特点，提出津枯血瘀、燥热成毒的发病机制，从清热解毒、活血生津入手，组成润燥灵汤，通过前期的临床观察和实验研究，取得了良好疗效[1]。为进一步明确其免疫调节机制，笔者通过免疫诱导法建立SS模型小鼠，探讨润燥灵方对SS模型小鼠的抗炎和免疫调节作用。

1 实验材料

1.1 实验动物 C57bl/6j小鼠90只，雌性，8周龄，SPF级，体质量（20.24±2.55）g，购自重庆腾鑫生物技术有限公司，动物许可证号：SCXK（軍）2012-0011。Lewis大鼠20只，雌性，8周龄，SPF级，体质量（150±20.70）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号：SCXK（京）2012-0001。均饲养于清洁级环境中。

1.2 实验药物 中药饮片由本院中药房提供，润燥灵由肿节风10 g、金银花10 g、白花蛇舌草10 g、当归10 g、赤芍15 g、生地黄15 g、玄参15 g等组成。上药加水浸泡10 min，煎煮2次，每次30 min，

合并滤液，浓缩成浓度5 g·mL-1，4 ℃冰箱保存备用。醋酸泼尼松龙片（浙江仙琚制药有限公司，生产批号1403104）。

1.3 实验试剂 百白破疫苗（武汉生物制品股份有限公司，生产批号20140104-2，由贵州省湄潭县卫生防疫站提供）；弗氏完全佐剂（SIGMA，SLBJ2845V贵州永博鑫生物科技有限公司）；考马斯亮兰试剂盒（南京建成生物工程研究所，生产批号20140710）；TRNzol-A总RNA提取试剂（天根生化科技北京有限公司，DP421）；StarScript Ⅱ First-stand cDNA Synthesis Mix（北京康润诚业生物科技有限公司，A214）；2×Taq PCR StarMix with Loding Dye（北京康润诚业生物科技有限公司，A112-10）；Mouse IL-17A Sunny ELISA Kit（联科生物技术有限公司，221741141）。

1.4 实验仪器 酶标仪（美国Bio Tek，EL × 800 V）；电泳仪（北京六一仪器厂，DYY-6C）；电子天平（常熟市天量仪器有限责任公司，Mettler toledo，AB104-N）；超纯水机（北京爱思泰克公司，ASTK，CSR-1-30型）；电热鼓风恒温干燥箱（上海一恒医疗器械有限公司，DHG-9070A）；制冰机（商丘艾斯比尔制冷设备有限公司，ZBJ-100PZ）；立式压力蒸汽灭菌锅（上海三申医疗器械有限公司，YM50Z）。

2 方 法

2.1 分组方法 将90只C57bl/6j小鼠随机分为空白对照组，模型对照组，醋酸泼尼松组和润燥灵高、中、低剂量组，每组15只。

2.2 模型建立 参照Cutler方法[2]，选取Lewis大鼠10只，采用质量分数为20%的乌拉坦麻醉后断颈处死，无菌分离颌下腺，电动匀浆，4 ℃，1000 r·min-1离心15 min，弃上清，向沉淀中加入1 mL PBS，再次匀浆、离心，重复4次。采用考马斯亮蓝比色法，测定抗原浓度为8.7 mg·mL-1，加入PBS稀释抗原浓度至2 mg·mL-1；再加入同体积弗氏完全佐剂，制备成最终抗原浓度为

1 mg·mL-1。C57bl/6j小鼠背部、腹部消毒后皮下多点注射抗原（每只0.2 mL），第2天予背部、腹部注射百白破疫苗0.5 mL，此后分别于第14天和第28天各加强免疫1次。

2.3 给药方法 从造模第4周开始灌胃给药，给药剂量按成人与小鼠体质量换算，以等效剂量为润燥灵中剂量，2倍为高剂量，1/2为低剂量。空白对照组、模型对照组均给予蒸馏水0.2 mL·d-1灌胃，醋酸泼尼松组给予等效剂量（2 mg·kg-1·d-1）醋酸泼尼松混悬液灌胃，润燥灵高、中、低剂量组分别给予润燥灵液50，25，12.5 g·kg-1·d-1灌胃。连续用药4周，于第28天末次给药2 h后眼球取血，采用质量分数为20%的乌拉坦麻醉后断颈处死小鼠，无菌分离小鼠颌下腺、胸腺、脾脏进行病理检测。

2.4 器官指数测定 无菌分离小鼠颌下腺、胸腺、脾脏，电子天平秤量质量，计算小鼠颌下腺、胸腺、脾脏指数。免疫器官指数=各免疫器官质量（mg）/

小鼠体质量（g）。

2.5 病理检测 将分离的小鼠颌下腺、胸腺、脾脏等免疫器官用质量分数为4%的多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，HE染色，在光镜下观察各免疫器官的病理变化。

2.6 IL-17的检测 采用ELISA法，按试剂盒说明书进行操作。按标准品浓度进行稀释、洗板、加样、温育、洗板、加酶、温育、显色、终止、测定等步骤进行，最后制定标准曲线。以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，用计算机软件进行回归拟合生成标准曲线。将样品OD值代入标准曲线计算出IL-17浓度。

2.7 统计学方法 采用SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料以表示，多组间比较用单因素方差分析。方差齐时，各组间两两比较采用LSD检验；方差不齐时，则采用Tamhance's T2检

验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 润燥灵对SS模型小鼠免疫器官指数的影响

与空白对照组比较，模型对照组小鼠颌下腺指数降低（P < 0.05），胸腺和脾脏指数升高（P < 0.01）。与模型对照组比较，醋酸泼尼松组和润燥灵高剂量组颌下腺指数均升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。与模型对照组比较，各治疗组胸腺、脾脏指数均有不同程度降低，以醋酸泼尼松组和润燥灵高剂量组降低较为显著，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。见表1。

3.2 润燥灵对SS模型小鼠免疫器官病理的影响

3.2.1 润燥灵对颌下腺病理的影响 空白对照组颌下腺腺泡大小均匀，排列整齐。模型对照组颌下腺小叶结构消失，腺泡、腺管结构紊乱，上皮细胞变性，溶解坏死，细胞周围导管增生，导管上皮细胞重叠，腺泡周围小血管增生、扩张、充血，细胞间可见少量浆细胞、淋巴细胞浸润。醋酸泼尼松组和润燥灵高剂量组颌下腺小叶结构基本存在，腺泡、导管分布均匀，排列稍紊乱，局部腺泡上皮细胞增生。润燥灵中、低剂量组颌下腺小叶结构消失，腺泡、腺管结构紊乱，局部小血管扩张、充血。见图1。

3.2.2 润燥灵对胸腺病理的影响 空白对照组胸腺皮质、髓质结构清楚，分布均匀，可见胸腺小体散在分布。模型对照组胸腺皮质、髓质结构紊乱，髓质区上皮细胞增生，皮质区淋巴细胞分布较多。醋酸泼尼松组和润燥灵高剂量组胸腺皮质、髓质结构尚存，髓质区胸腺上皮细胞轻度增生。润燥灵中剂量组胸腺皮质、髓质结构稍紊乱，髓质区胸腺上皮细胞轻度增生，皮质区萎缩。润燥灵低剂量组胸腺皮质、髓质结构紊乱，髓质区胸腺上皮细胞增生，皮质区淋巴细胞较润燥灵中剂量组增多。见

图2。

3.2.3 润燥灵对脾脏病理的影响 脾脏病理结果显示，空白对照组脾脏被膜分布均匀，红髓、白髓分布整齐，排列均匀。模型对照组脾脏结构广泛破坏，白髓及脾小体增生明显，见大量淋巴细胞、单核巨噬细胞及多核巨噬细胞增生，红髓萎缩明显，脾血窦结构不清。醋酸泼尼松组脾脏被膜分布较均匀，红髓、白髓分布较整齐，排列较均匀，脾血窦分布于脾小体之间。润燥灵高剂量组脾红髓、白髓分布不规则，排列不均匀，伴有白髓区域淋巴细胞轻度增生。润燥灵中剂量组脾脏部分结构破坏，白髓区域淋巴細胞、多核巨噬细胞明显增生。润燥灵低剂量组脾脏结构广泛破坏，病理表现接近模型对照组。见图3。

3.3 润燥灵对SS模型小鼠血清IL-17分泌的影响

每组随机抽取10只小鼠血清进行ELISA检测，结果显示，模型对照组小鼠IL-17的分泌量明显高于空白对照组（P < 0.01），各给药组均能不同程度降低小鼠血清IL-17的分泌量，其中醋酸泼尼松组和润燥灵高、中剂量组降低比较明显（P < 0.01）。润燥灵中、低剂量组与醋酸泼尼松组比较，差异有统计学意义（P < 0.01）。见表2。

4 讨 论

SS属中医学“燥毒”“燥证”“燥痹”等范畴。根据SS的发病特点，笔者认为阴虚、燥毒、瘀血是发病的主要病因[3]，以毒蕴血瘀为依据组成润燥灵方，经前期的临床研究证实对改善SS临床症状和体征具有较好疗效[1]。课题组在前期的动物实验中发现，润燥灵方能够下调SS模型小鼠涎腺组织水分子通道蛋白1，5（AQP1、AQP5）的表达，改善模型小鼠的饮水量[4-7]。方中君药肿节风清热解毒；臣药金银花、白花蛇舌草，助君药清热解毒；佐药当归、赤芍活血化瘀；使药生地黄、玄参养阴生津。诸药合用，具有解毒、活血、生津之功，在清热解毒的同时，辅以活血化瘀、生津润燥。本研究通过润燥灵对SS模型小鼠的干预治疗研究，发现SS模型对照组小鼠颌下腺指数较空白对照组明显减小，说明SS小鼠腺体结构发生改变。除润燥灵低剂量组外，用药组颌下腺指数均大于模型对照组，醋酸泼尼松组及润燥灵高、中剂量组均能减轻SS小鼠颌下腺病理损伤，其中醋酸泼尼松组与润燥灵高剂量组颌下腺指数无显著差异，2组对SS小鼠颌下腺病理损伤的治疗效果相当。胸腺是T细胞分化及发育的场所，当T细胞增值时，胸腺的体积及质量会增加[8]。脾脏是机体最大的外周淋巴器官，其中有大量T、B淋巴细胞，当这些细胞受到抗原刺激时，T、B淋巴细胞会克隆增殖，导致脾脏的体积及质量增加，所以脾脏和胸腺指数也可间接反应机体的免疫状态[8-9]。本实验通过测量胸腺及脾脏指数，发现模型对照组小鼠胸腺及脾脏指数较空白对照组明显增大，说明模型对照组小鼠处于免疫亢进的状态。各用药组小鼠胸腺及脾脏指数均小于模型对照组，润燥灵高剂量组胸腺及脾脏指数与空白对照组比较，差异无统计学意义

（P ﹥ 0.05）。研究结果说明中药润燥灵对免疫器官有一定的调节作用。

病理研究发现，醋酸泼尼松组及润燥灵高剂量组均对颌下腺有治疗作用，能够减少浆细胞、淋巴细胞的浸润，恢复颌下腺的正常生理结构，而润燥灵中、低剂量对SS模型小鼠颌下腺的病理影响不明显。说明润燥灵高剂量组能够有效调节胸腺的免疫状态，而润燥灵中、低剂量组对胸腺的调节作用较差。脾脏病理切片结果显示，醋酸泼尼松组较润燥灵高剂量组对脾脏的免疫调节作用强，而润燥灵中、低剂量对脾脏的免疫调节作用较小。

Th17细胞是一种新型CD4+Th细胞亚群，主要分泌IL-17、IL-6、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎性细胞因子，诱发炎症反应。有研究证实，IL-17与SS患者的腮腺肿大明显相关[10]。SS患者血清IL-17的分泌水平升高，尤其是抗核抗体滴度高和类风湿因子阳性的患者更明显[11]。IL-17作为Th17细胞与自身免疫疾病之间的关键纽带，是Th17细胞分泌的代表性因子，具有强烈的促炎作用，可以诱导促炎细胞因子和趋化因子，刺激基质金属蛋白酶表达，导致急性期反应蛋白产生，引起组织破坏[12]。在自身免疫疾病的治疗过程中运用调控IL-17阻断炎症作用的方法，可以取得较好的疗效。本次实验中笔者运用中药润燥灵对SS模型小鼠血清IL-17的分泌情况进行研究，结果显示，醋酸泼尼松组及润燥灵高、中、低剂量组均能下调IL-17的表达，从而抑制炎症反应发生。润燥灵高剂量组作用比较明显，润燥灵中、低剂量组下调IL-17的作用不及醋酸泼尼松及润燥灵高剂量组。

综上所述，中药润燥灵能增加SS模型小鼠颌下腺指数，降低胸腺和脾脏指数，并降低SS模型小鼠血清IL-17分泌量；调节SS模型小鼠免疫功能，降低致炎因子IL-17表达，达到治疗SS的作用。

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收稿日期：2017-03-17；修回日期：2017-04-25