自交联共轭亚油酸囊泡的钙稳定性及钙响应性研究

魏 贝，闫引星，夏咏梅，方 云

（江南大学化学与材料工程学院，江苏无锡，214122）

自交联共轭亚油酸囊泡的钙稳定性及钙响应性研究

魏 贝，闫引星，夏咏梅，方 云

（江南大学化学与材料工程学院，江苏无锡，214122）

脂肪酸囊泡（FAV）是一种成分简单、安全价廉的载体，可以起到与脂质体或微胶囊类似的作用。本实验以廉价易得且具有生理活性、自组装活性和自交联活性的共轭亚油酸（CLA）为分子砌块，通过自交联反应制备稳定的共轭亚油酸囊泡（CLA-FAV）。研究了该自交联CLA-FAV的钙稳定性及钙响应性。揭示了自交联CLA-FAV作为潜在活性物包埋空间和释放通道具有钙刺激响应性，可能成为一种潜在的钙响应型载体，为CLA-FAV应用在化妆品及洗涤用品行业提供了新思路。

共轭亚油酸；脂肪酸囊泡；钙稳定性；钙响应性

为了改善洗涤性能或使洗涤后的织物具有良好的香气，在洗涤剂配方中需要加入香精或活性物，但是这类物质容易受到外界环境如光、热和pH等影响，或易与配方中的表面活性剂和漂白剂发生作用，往往需要利用成膜材料将活性物以及易挥发的原料包覆起来。脂肪酸囊泡（Fatty Acid Vesicle, FAV）是一种价廉易得且安全性很高的具有包埋缓释功能的载体，其特有的亲水性空腔和疏水性双分子层能同时包埋亲水性和疏水性物质，但其胶体稳定性差限制了推广应用[1-2]。共轭亚油酸是对人体健康有益的脂肪酸，它的自组装体有望成为安全和生物相容性良好的药物载体。本实验室前期实验已经表明，通过自组装和自交联可以成功得到稳定的共轭亚油酸囊泡，它们可在整个pH范围内保持稳定[3-4]并具有一定的温度响应性[5]。在个人洗护用品和洗涤剂的配方和使用过程中，钙离子浓度存在较大差异，因此，研究CLA-FAV的钙稳定性及钙响应性对于其在家用清洁和个人护理用品等领域将有较大的应用价值。

1 实验

1.1 实验药品及仪器

共轭亚油酸（Conjugated Linoleic Acid，CLA）从红花籽油（中粮塔原红花（新疆）有限公司）经皂化、尿素包合和碱异构化法制备（液相色谱面积归一化纯度96%）[6]；超纯水（电阻率18.2 MΩ·cm）；硼酸、四硼酸钠、五-氟尿嘧啶（5-FU）、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、[3-（3,4-二甲基-9-氧代-9-氢-噻吨-2-氧基）-2-羟丙基]三甲基氯化铵（[3-（3,4-Dimethyl-9-oxo-9H-thioxanthen-2-yloxy）-2-hydroxypropyl] trimethylammonium chloride，QTX）等化学试剂均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

紫外－可见分光光度计，T6新世纪，北京普析通用仪器有限公司；透射电子显微镜（TEM），JEM-2100，日本电子株式会社；激光光散射仪（DLS），ALV/DLS/SLS-5022F型，德国Hosic Limited公司；恒温培养振荡箱，ZHWY-100B，上海智城分析仪器制造有限公司。

1.2 实验方法

（1）自交联CLA-FAV的制备和形貌表征

配制 3mmol/L，pH 8.6（硼砂-硼酸缓冲液）的CLA溶液，室温下静置4 h任其自组装。取10 mL自组装后的CLA水溶液于25 mL具塞比色管中，加入20μL水溶性光引发剂QTX（0.22 mol/L），通入30min的氮气以排除瓶内的氧气，后盖上瓶塞并用保鲜膜密封，用紫外灯辐照引发CLA组装体的自交联反应，获得CLA的自交联CLA-FAV溶液。将自交联前后的CLA-FAV溶液用pH 8.6缓冲液稀释至0.06 mmol/L，用紫外－可见分光光度计测其紫外光谱，根据CLA溶液在234 nm处的吸光度与浓度间的紫外吸收标准曲线（Abs = 19.229 c + 0.0039，R2= 0.9997，c为CLA浓度，mmol/L）判断其聚合程度。将自交联后的CLA-FAV溶液用0.45 μm的PVDF微孔滤膜过滤至样品瓶中，用DLS法在90℃测定CLA-FAV的粒径分布。将自交联后的CLA-FAV溶液滴在铜网上，用滤纸吸去多余溶液，自然干燥后获得TEM影像（120 kV）。

（2）自交联CLA-FAV的钙稳定性及钙响应性

用DLS法和TEM表征不同CaCl2浓度下pH 8.6的自交联CLA-FAV溶液的形貌和粒径。

（3）自交联CLA-FAV的缓释

称取26.4 mg 5-FU，直接加入到pH 8.6的CLAFAV溶液中，于25 ℃下在80 r/min恒温培养振荡箱中振摇24 h，制备包覆5-FU （c = 1 g/L）的CLAFAV。将该CLA-FAV交联后（交联度70 %），取5 mL于透析袋（截留相对分子质量为3500），置于200 mL的透析液中，在恒温培养振荡箱中透析一段时间，除去游离5-FU。然后将该透析袋放入新鲜的200 mL 0.1 mol/L的PBS透析液（磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液，pH 8.6）中，在恒温培养振荡箱中进行释放实验。每10 min取样5 mL，并补加5 mL新鲜的透析液，测定样品在最大吸收波长处的吸光度，根据5-FU的标准曲线（Abs = 51.539 c + 0.0256，R2= 0.9995, c为5-FU浓度，mg／L）计算累积释放百分率。

2 结果与讨论

2.1 自交联CLA-FAV的形貌和粒径

由自交联CLA-FAV溶液在234 nm处的吸光强度判断CLA分子间的自交联程度。图1 A为3 mmol／L的CLA溶液紫外聚合前后的紫外聚合曲线，结果表明，延长聚合时间使双键的紫外吸收减弱，说明自交联度增大。自交联反应0.5 h交联度达到51 %，自交联反应1 h交联度达到70 %。图1 B为自交联前CLA-FAV溶液的DLS图，结果显示，囊泡平均粒径为15 nm；图1 C为交联度70 %的CLA-FAV的TEM图，显示其为10～20 nm粒径的单层囊泡。

2.2 自交联CLA-FAV的钙稳定性及钙响应性

调节交联度为70 %的CLA-FAV的Ca2+浓度发现，2.73 mmol/L以下溶液呈透明状，以上则溶液变浑浊，说明此时CLA-FAV不再稳定，易于解体。图2用DLS测定了自交联后CLA-FAV在Ca2+浓度为0.91、1.36、1.82和2.27 mg/L的水化半径Rh，与无钙时的7.5 nm相比，粒径分别增大了17 %、28 %、45 %和72 %；根据体积与半径的关系，CLA-FAV体积膨胀到1.6、2.1、3.1和5.1倍。图2中用TEM影像直接证实了CLA-FAV的形貌和粒径。这一实验结果表明，若将该CLA-FAV用于植物洗涤剂或人体清洁护理用品，在配方中可以维持包埋香精或其他有效成分的长期稳定，使用时，遇到硬水后CLA-FAV膨胀有利于被包埋物质缓释，达到预期效果。

图1 （A）自交联前后CLA-FAV的紫外光谱，（B）自交联前CLAFAV的水合半径，（C） 自交联后CLA-FAV（交联度70 %）的TEM

图2 Ca2+浓度对CLA-FAV（交联度70%）的Rh分布和形貌的影响

而调节交联度为51%的CLA-FAV的Ca2+浓度发现，1.36 mmol/L以下溶液呈透明状，以上则溶液变浑浊，并发生明显分相，图3表明，散射光强也大幅度降低，说明此时CLA-FAV不再稳定，易于解体。图3用DLS测定了自交联后CLA-FAV在Ca2+浓度为0.45和0.91 mg/L的水化半径Rh，与无钙时的7.5 nm相比，粒径分别增大了12%和168%；根据体积与半径的关系，CLA-FAV体积膨胀了1.4和19.2倍。同时，图3中的TEM影像显示，前者的粒径分布在12.8～19.2 nm，平均粒径为15.8 nm（n=30），后者的粒径分布在32.1～44.2 nm，平均粒径为38.7 nm（n=25），与DLS结果吻合。这一实验结果表明，若将该CLA-FAV应用于硬水中时，CLA-FAV破裂解体而达到生物酶等活性物质的快速释放，提高了洗涤性能。

2.3 自交联CLA-FAV对5-FU的缓释性能

5-FU是一种普遍用于包埋缓释的模型药，5-FU的最大吸收波长在265 nm处，利于紫外检测其含量，因此，以5-FU为模型，研究自交联CLA-FAV的缓释性能。以0.1 mol/L的PBS缓冲液（pH=8.6）为透析液，控制5-FU的初始浓度为1 g/L。如图4所示，游离5-FU与载体包埋5-FU的体外释放速率存在显著差异，100 min左右游离5-FU基本释放完全，而CLA-FAV包埋的5-FU才达到释放平衡，且释放达到平衡之后，又持续了较长时间的恒定缓慢的释放。这表明所制备的自交联CLA-FAV有比较明显的缓释作用。

图3 Ca2+浓度对CLA-FAV （交联度为51%）的影响

图4 37℃下CLA-FAV包埋5-FU在PBS缓冲液中的释放行为

3 结论

本实验的研究结果表明，交联程度为70%的CLA-FAV具有较好的钙稳定性，在钙离子浓度2.73 mmol/L以下均可以稳定，有助于在硬水中应用时CLA-FAV膨胀而达到缓释效果；自交联程度越低（交联度为51%）的CLA-FAV钙响应性越好，在钙离子浓度1.36 mmol/L以下具有较大的膨胀度，而在1.36mmol/L以上能够迅速解体而达到生物酶等活性物质的快速释放，提高洗涤性能。因而，自交联CLA-FAV可能成为一种潜在的钙响应型载体。

[1] Morigaki K, Walde P. Fatty acid vesicles[J]. Current Opinion in Colloid and Interface Science, 2007, 12(2): 75-80.

[2] Gebicki J, Hicks M. Ufasomes are stable particles surrounded by unsaturated fatty acid membranes[J]. Nature, 1973, 243(5404): 232-234.

[3] Fan Y, Fang Y, Ma L. The self-crosslinked ufasome of conjugated linoleic acid: investigation of morphology, bilayer membrane and stability[J]. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2014, 123 : 8-14.

[4] 梁潇丹, 方云. 两性表面活性剂椰油酰胺丙基甜菜碱与共轭亚油酸复合形成囊泡的研究[J]. 中国洗涤用品工业, 2016 (4) : 35-39.

[5] Dai J, Fan Y, Fang Y. Temperature-responsive Expansion of Self-crosslinked Ufasomes of Conjugated Linoleic Acid[J]. Chemical Journal of Chinese Universities-Chinese, 2015, 36(6): 1140-1145.

[6] 马琳, 樊晔, 吴业帆, 等. 天然不饱和脂肪酸改性制备共轭亚油酸[J]. 大豆科学, 2012(5): 846-851.

A Research on Calcium Stability and Responsiveness of Selfcrosslinked Vesicles of Conjugated Linoleic Acid

Wei Bei, Yan Yinxing, Xia Yongmei, Yun Fang＊
(School of Chemical and Material Engineering, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu Province, China)＊E-mail: yunfang@126.com

∶ Fatty acid vesicle (FAV) is a simple, inexpensive and safe carrier that can act as microcapsule. In this paper, conjugated linoleic acid (CLA), which has bioactivity, self-assembling activity and self-crosslinking activity, was used as molecular block to obtain stable fatty acid vesicles through self-crosslinking.The calcium stability and calcium-responsive of the self-crosslinked CLA-FAV were studied.The results showed that self-crosslinked CLA-FAV has calcium-responsive which was favorable for controlled release, indicating self-crosslinked CLA-FAV has a promising prospect of application in the felds of cosmetics and detergent industry.

∶ Calcium stability; Calcium responsiveness; Conjugated Linoleic Acid; Fatty acid vesicle

TQ423.11；TQ645.6

A

1672-2701（2017）08-28-05

国家重点专项计划（2017YFB 0308700）；国家自然科学基金（21606107）；江苏省普通高校研究生实践创新计划项目（SJZZ15_0145）；国家大学生创新训练计划项目（201610295014）。

魏贝女士，在读硕士研究生，主要研究方向：日用化工与精细化工；E-mail：weibei1211@163.com。

责任作者：方云先生，博士，教授，博士生导师；E-mail：yunfang@126.com。