益生菌发酵瓯柑汁及主要抗氧化成分研究

曹雪丹，郭小，陈林星，方修贵，赵凯，李二虎

（1.浙江省柑橘研究所，浙江台州318026；2.华中农业大学食品科学技术学院，湖北武汉430070）

益生菌发酵瓯柑汁及主要抗氧化成分研究

曹雪丹1，郭小2，陈林星2，方修贵1，赵凯1，李二虎2

（1.浙江省柑橘研究所，浙江台州318026；2.华中农业大学食品科学技术学院，湖北武汉430070）

选用益生菌（副干酪乳杆菌）在微量需氧的条件下对瓯柑汁进行益生菌发酵，发酵温度36℃，时间10 d。在发酵前后对活菌数、pH值和可溶性固形物含量及主要抗氧化成分进行检测。结果表明：通过发酵，活菌数由初始的（5.6±0.20）log CFU/mL显著增加至（7.2±0.30）log CFU/mL，pH值和可溶性固形物含量则显著降低（p＜0.05）；同时，总酚含量显著升高（p＜0.05），总类胡萝卜素和4种主要黄酮类化合物含量均显著下降（p＜0.05）；各黄酮类化合物的减少幅度由大到小依次为：橙皮苷＞柚皮苷＞枸橘苷＞新橙皮苷。常温贮藏10 d对各项指标的影响不大，且活菌数仍然保持在较高水平。可见，瓯柑汁适宜研制益生菌发酵型果汁饮品。

副干酪乳杆菌；瓯柑；发酵；抗氧化成分

瓯柑（Citrus suavissima Hort.ex Tanaka）是分布在浙江省第二大水系——瓯江沿岸的特色水果，在温州地区已有上千年的栽培历史[1]。由于瓯柑具有祛热生津、化痰止咳、清凉解毒等特殊的医药效能，所以在民间常把瓯柑与解热镇痛的中药“羚羊角”相提并论。经研究发现，瓯柑不但含有丰富的维生素等营养成分，还含有大量的黄酮类化合物以及酚类物质和类胡萝卜素等抗氧化活性功能成分。如张九凯[2]从瓯柑果实中鉴定出8种黄酮类化合物，包括4种黄烷酮糖苷（柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和枸橘苷）和4种多甲氧基黄酮（甜橙黄酮、川陈皮素、橘皮素和5-去甲川陈皮素）；朱晓艳[3]测定了瓯柑中总酚及6种主要的黄酮类化合物（柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、枸橘苷、川陈皮素和橘皮素）含量及其抗氧化活性的变化规律等。相比于大多数柑橘而言，类黄酮等抗氧化成分才是瓯柑主要的营养价值所在。但瓯柑果实滋味较淡，且略显苦涩，无论鲜食还是加工成果汁都与主流的柑橘或橙汁存在较大的口感差异。

益生菌（Probiotics）是指一类对生命或健康有益的微生物，主要包括细菌和真菌等。世界卫生组织（WHO）明确指出发酵制品中的益生菌活菌数达到7.0 Log CFU/mL就能对人体产生积极的影响，而且通过益生菌发酵还可以保持或改善果蔬的营养及感官特性[4]，如Yu等[5]采用乳酸菌发酵的方法改良了新会茶枝柑（Citrus reticulate cv.chachiensis）果汁的口感，提高了糖酸比例。本文选用在人体肠道中具有较强定植能力的副干酪乳杆菌为原料，采用不添加外来营养物质的方法进行瓯柑汁的益生菌发酵，并对不同发酵阶段瓯柑汁中的活菌数和总酚、总胡萝卜素和类黄酮等主要抗氧化成分进行初步研究，以期为丰富瓯柑加工制品、开发营养型瓯柑发酵汁提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

瓯柑：产自浙江省温州市，由浙江森马生态农业发展有限公司提供；发酵剂（副干酪乳杆菌Lpc-37）：德国丹尼斯克（Danisco）公司；柚皮苷（≥98%）、橙皮苷（≥98%）、新橙皮苷（≥98%）和枸橘苷（≥98%）：美国斯坦福（Stanford）分析化学公司；MRS培养基：北京陆桥技术责任有限公司；乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯）等：美国天地（Tedia）公司；福林-酚试剂：上海荔达生物科技有限公司；没食子酸（≥98%）：上海伊卡生物技术有限公司；β-胡萝卜素（≥98%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

MJ-176NR型榨汁/搅拌机：日本松下（Panasonic）电器产业株式会社；BHS-1型数显恒温水浴锅：福州泰美试验仪器有限公司；LC-20型高效液相色谱仪（带SPD-M20A型PDA检测器）：日本岛津（Shimadzu）公司；Biospecrtometer紫外/可见光分光光度计：德国艾本德（Eppendorf）公司；玻璃伏菜坛：市售；FG2型便携式pH计：瑞士梅特勒-托利多（Mettler-Toledo）公司；PAL-3型手持式数显糖度计：日本爱宕（Atago）公司；LabServ CO150型CO2培养箱：美国热电（Thermo）公司。

1.2 瓯柑汁的发酵

先将新鲜瓯柑剥去果皮并剔除种子，再用家用榨汁机打成浆状经80目纱布过滤，加热至70℃保温5 min后移入玻璃伏菜坛中，静置冷却至室温（20±1）℃，准确称取并投放发酵剂，搅拌均匀后发酵0 d并取样，将坛口加水密封并于36℃水浴中保温发酵10 d后取样，再于室温下后贮藏10 d再次取样。

1.3 活菌数的检测

采用平板计数法[6]。先将瓯柑汁样品充分摇匀后以无菌吸管吸取25 mL放入装有225 mL 0.85%生理盐水的无菌锥形瓶中，摇匀即为10倍稀释液。再将此稀释液选择2个～3个适宜的稀释度，各以0.1 mL加入到MRS平板进行涂布，置于36℃的CO2培养箱中厌氧培养48 h，进行计数。重复3次，取平均值。

1.4 pH值和可溶性固形物（TSS）的测定

分别采用pH计法和折光计法。重复3次，取平均值。

1.5 总酚的测定

采用福林-酚比色法[7]。称取3 mL瓯柑汁样品，用20 mL 80%甲醇研磨搅拌，在4℃下浸提12 h以上，于8 000 r/min离心 20 min，过滤，洗渣，定容至 25 mL，即为样品提取液，-22℃冻存待测。

1.6 总类胡萝卜素的测定

采用比色法[8]。取10 mL瓯柑汁样品加入20 mL的混合有机溶剂（正己烷∶丙酮∶乙醇=2∶1∶1，体积比），经磁力搅拌30 min后在，于5℃下6 500 r/min离心5 min，取上层清液待测[9]。

1.7 黄酮类化合物的测定

1.7.1 标准液制备

准确称取柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和枸橘苷的标准品各20.0 mg，分别用乙腈充分溶解并定容至100 mL，即得浓度为200.0 mg/L的标准液，再经微孔滤膜（0.45 μm）过滤，备用。

1.7.2 样品的制备

取瓯柑汁样品在3 000 r/min下离心20 min，准确移取5 mL上清液于容量瓶中，并用乙腈定容至10 mL。超声振荡处理10 min，再经微孔滤膜（0.45 μm）过滤，待测。

1.7.3 HPLC色谱条件

采用 Agilent C18柱（TC，4.6 mm×250 mm），流动相为水和乙腈，洗脱梯度为：0～4 min，保持乙腈15%不变；4 min～12 min，乙腈 15%～50%；12 min～16 min，保持乙腈50%不变；16 min～18 min，乙腈50%～15%；18 min～22 min，保持乙腈15%，至循环结束。流速0.7 mL/min，柱温 25 ℃，进样量 10 μL，检测波长为287 nm[10]。

1.7.4 标准曲线的绘制

分别精确移取柚皮苷、橙皮苷和枸橘苷标准液1.25、2.5、5.0、10.0、20.0 mL（新橙皮苷标准液 2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 mL）于 50 mL 容量瓶中，乙腈定容，在相同条件下进行HPLC测定。以标样的浓度（mg/L）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，如图1。

1.8 数据处理

使用SPSS软件对数据进行差异显著性分析（LSD法），用EXCEL软件绘图。

图1 柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和枸橘苷标准曲线Fig.1 Standard curve of naringin，hesperidin，neohesperidin and poncirin

2 结果与分析

2.1 益生菌发酵瓯柑汁中活菌数及pH值和TSS含量的变化

Lpc-37副干酪乳杆菌是近年来国外研究较多的一种益生乳酸细菌，这类菌广泛的存在于传统发酵乳制品和人体胃肠道中，还有少量报道表明也可从泡菜、发酵豆制品、发酵鱼制品以及一些酒类如低度清酒和白兰地中分离得到该菌种[11]。王德纯等[12]指出Lpc-37能够耐受较低的pH值环境，具有很强的黏附人体上皮细胞系能力，通过人体实验证实该种副干酪乳杆菌可以提高特异性免疫球蛋白LgG的感应能力，维持宿主胃肠道中双歧杆菌的平衡，并改善其微生态环境[13]。本文分别在发酵0 d、保温发酵10 d和常温贮藏10 d 3个不同阶段取样检测瓯柑汁中的活菌数、pH值和TSS含量，结果如表1所示。

表1 不同发酵阶段瓯柑汁中活菌数的变化Table 1 Changes of the viable count in different stage during fermentation with Lactobacillus paracasei

活菌数是决定益生菌发酵制品功能特性的关键因素。在发酵初始，瓯柑汁中的副干酪乳杆菌接种浓度约为（5.6±0.20）log CFU/mL。在36℃下保温发酵10 d后活菌数显著升高至（7.2±0.30）log CFU/mL（p＜0.05），即达到了WHO组织的建议浓度：7.0 log CFU/mL。在室温条件下继续贮藏10天后，活菌数显著降低（p＜0.05）。这一趋势与Filannino P等[14]使用3种不同乳酸菌于30℃下发酵（5 d）和4℃下贮藏（30 d）石榴汁所测得活菌数变化规律相似。

通过10 d保温发酵，pH值和TSS含量相比初始值显著降低（p＜0.05）；常温贮藏10 d后瓯柑汁pH值未发生明显的变化，但是TSS含量却显著下降（p＜0.05），这可能是由于发酵结束后瓯柑汁中的活菌在常温条件下仍然能够继续缓慢生长和代谢消耗所致。

2.2 益生菌发酵瓯柑汁中主要抗氧化成分含量的变化

柑橘类水果通常含有较高的抗氧化活性物质[15]，这些抗氧化成分主要包括类胡萝卜素[16]、多酚[17]、黄酮[18]及花色苷[19]等，具有防止心血管疾病、延缓衰老、抑制癌症发生等生理作用[20]。本文分别在发酵0 d、保温发酵10 d和常温贮藏10 d 3个不同阶段取样检测瓯柑汁中的总酚、总类胡萝卜素和4种主要黄酮类化合物含量，结果如表2所示。

酚类物质是柑橘果实中一类主要的次生代谢产物，不仅有着重要的生理功能，而且可能是柑橘果实抗氧化活性的主要贡献者之一[21]。由表2可知，发酵后瓯柑汁中总酚含量显著升高（p＜0.05），且维持在发酵前的约1.3倍水平至贮藏结束时也没有明显降低，这可能会对瓯柑汁的抗氧化活性产生积极的影响。而总类胡萝卜素含量在发酵过程中损失殆尽，具体原因和对瓯柑汁抗氧化活性的影响尚待进一步研究。

4种主要存在于瓯柑果肉中的黄酮类化合物分别为：柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和枸橘苷，其中新橙皮苷为瓯柑中最主要的黄酮类化合物，含量达到591.52 mg/L～692.42 mg/L，这与张九凯[2]、朱晓艳[3]的研究结果相一致。枸橘苷是瓯柑特有的黄酮类化合物，仅在葡萄柚和胡柚中检测出较低含量，在脐橙、柠檬和温州蜜柑等均未检出[3]。但是经过发酵后，这4种黄酮类化合物含量均显著降低（p＜0.05），而在常温条件下贮藏10 d的变化并不明显（除新橙皮苷外）。其中橙皮苷在发酵过程中损失最大，含量减少了近1/2；而新橙皮苷含量在发酵过程中仅减少了约8%左右，柚皮苷和枸橘苷分别减少了约30%和25%；至贮藏结束时，新橙皮苷含量仍保持在发酵初始值的85.40%，维持了较高的水平。

表2 不同发酵阶段瓯柑汁中主要抗氧化成分含量的变化Table 2 Changes of the main antioxidants content in different stage during fermentation with Lactobacillus paracasei

3 结论

副干酪乳杆菌（Lpc-37）可在瓯柑汁中正常发酵，且通过36℃保温发酵10 d后活菌数由初始的（5.6±0.20）log CFU/mL 显著增加至（7.2±0.30）log CFU/mL，pH值和TSS含量则显著降低（p＜0.05），在常温条件下贮藏10 d也无明显变化。瓯柑汁发酵前后除总酚含量显著升高外，总类胡萝卜素和4种主要黄酮类化合物含量均显著下降（p＜0.05），其中总类胡萝卜素含量几乎消耗殆尽，而各黄酮类化合物的减少幅度也有所差异，降幅大小依次为：橙皮苷＞柚皮苷＞枸橘苷＞新橙皮苷。

[1]徐象华,颜福花,叶荣华,等.瓯柑研究进展[J].浙江林业科技,2008,28(3)：75-77

[2]张九凯.瓯柑和胡柚果实黄酮类化合物组分鉴定、分离纯化及生物活性研究[D].杭州：浙江大学,2013

[3]朱晓艳.瓯柑果实黄酮类化合物的分离鉴别及相关活性研究[D].杭州：浙江大学,2012

[4]Di Cagno R,Coda R,Angelis M D,et al.Exploitation of vegetables and fruits through lactic acid fermentation[J].Food Microbiology,2013,33(1)：1-10

[5]Yu Y,Xiao G,Xu Y,et al.Slight fermentation with Lactobacillus fermentium improves the taste(sugar：acid ratio)of citrus(Citrus reticulate cv.chachiensis)juice[J].Journal of Food Science,2015,80(11)：2543-2547

[6]中华人民共和国卫生部.GB 4789.35-2010食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验[S].北京：中国标准出版社,2010

[7]Singleton V L,Orthofer R,Lamuela-Raventos R M.Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of folin-ciocalteu reagent[J].Methods in Enzymology,1999,199：152-178

[8]国家技术监督局.GB/T 12291-1990水果、蔬菜汁类胡萝卜素全量的测定[S].北京：中国标准出版社,1990

[9]胡建中,王可兴,潘思轶.高效液相色谱法测定柑橘汁中的类胡萝卜素[J].食品科学,2006,27(12)：634-636

[10]陈静,高彦祥,吴伟莉.高效液相色谱法测定柑橘汁中的柠檬苦素和柚皮苷[J].色谱,2006,24(2)：157-160

[11]苑婷婷.产细菌素Paracin17菌株群体感应行为初探[J].哈尔滨：黑龙江大学,2010

[12]王德纯,朱春梅,金苏.益生菌副干酪乳杆菌lpc-37的健康功能概述 [C].银川：中国乳制品工业协会第十六次年会文件汇编,2010,24-28

[13]赵法伋,金苏,张力,等.丹尼斯克Bi-07及Lpc-37益生菌粉剂对胃肠道系统健康功效改善的临床研究[J].中华疾病控制杂志,2011,15(3)：256-259

[14]Filannino P,Azzi L,Cavski I,et al.Exploitation of the health-promoting and sensory properties of organic pomegranate(Punica granatum L.)juice through lactic acid fermentation[J].International Journal of Food Microbiology,2013,163：184-192

[15]吴丽芬,庞玉新,杨全,等.柑橘属植物抗氧化活性物质及其机理研究进展[J].广东药学院学报,2014(4)：521-524

[16]田明,徐晓云,范鑫,等.柑橘中主要类胡萝卜素及其生物活性研究进展[J].华中农业大学学报,2015,34(5)：138-144

[17]张华,周志钦,席万鹏,等.15种柑橘果实主要酚类物质的体外抗氧化活性比较[J].食品科学,2015,36(11)：64-70

[18]Majo D D,Giammanco M,Guardia M L,et al.Flavanones in Citrus fruit：Structure-antioxidant activity relationships[J].Food Research International,2005,38(10)：1161-1166

[19]Wang S Y,Lin H.Antioxidant activity in fruits and leaves of blackberry,raspberry,and strawberry varies with cultivar and developmental stage[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2000,48(2)：140-146

[20]林臻.柑橘果皮与果络含水乙醇萃取物抗氧化、抗发炎及抑制幽门螺旋杆菌生长之研究[D].台中：中山医科大学,2010

[21]张元梅.中国野生宽皮柑橘酚类物质的检测及其抗氧化活性研究[D].重庆：西南大学,2013

Research on Probiotics Fermentation Pleasant Orange Juice and the Main Antioxidant Components

CAO Xue-dan1，GUO Xiao2，CHEN Lin-xing2，FANG Xiu-gui1，ZHAO Kai1，LI Er-hu2
（1.Zhejiang Citrus Research Institute，Taizhou 318026，Zhejiang，China；2.College of Food Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，Hubei，China）

In this research，production of probiotic pleasant orange juice through its fermentation by lactic acid bacteria （Lactobacillus paracasei）was examined.Fermentation was carried out at 36℃ for 10 d under microaerophilic conditions.Viability counts，pH，total soluble solid and the main antioxidant components were measured in the before and after fermentation.The result indicated that viability counts increased to（7.2±0.30）log CFU/mL from （5.6±0.20）log CFU/mL after 10 d of fermentation，pH and total soluble solid were significantly reduced（p＜0.05），and total phenol content increased significantly（p＜0.05），total carotenoid and four major flavonoids were significantly reduced （p＜0.05）.The reduction of flavonoids from large to small in order：hesperidin＞naringin＞poncirin＞neohesperidin.There was no significant effect on the indicators for 10 d of storage at room temperature，and the number of viable cells remained at a relatively high level.Therefore，pleasant orange juice was proved to be a suitable media for production of a femented probiotic drink.

Lactobacillus paracasei；pleasant orange；fermentation；antioxidant components

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.17.024

2017-06-14

曹雪丹（1980—），男（汉），助理研究员，硕士，研究方向：果品贮藏及加工。