超声波-复合酶耦合法制备花生粕抗氧化肽研究

马利华，宋慧，陈学红，陈铎

（徐州工程学院食品学院，江苏徐州221008）

超声波-复合酶耦合法制备花生粕抗氧化肽研究

马利华，宋慧，陈学红，陈铎

（徐州工程学院食品学院，江苏徐州221008）

以花生粕为原材料，花生粕抗氧化肽含量、DPPH自由基清除率为指标，研究不同酶解时间、超声处理时间、超声波功率、酶解温度等处理条件对花生粕抗氧化肽提取效果的影响。研究花生粕抗氧化肽对3种自由基的清除效果。试验结果表明：最佳提取条件为：底物浓度8%，超声波功率为150 W、超声处理时间5 min、酶解温度为45℃、酶解时间为1.5 h，此条件下花生粕抗氧化肽含量7.01 mg/mL，DPPH自由基清除率达到89.22%。超声波-复合酶耦合法制备的花生粕抗氧化肽对3种自由基均有较强的清除能力，且清除醇溶性自由基能力最强。

花生粕；肽；超声波-复合酶；提取；抗氧化

花生粕是从花生仁经压榨提炼油料后的产品，富含植物蛋白和人体必需的八种氨基酸，脂肪含量少，蛋白质变性程度小，水分含量低，可消化性高，有丰富的营养价值，可以作为一种优质蛋白质来源[1-2]。

酶法生产的生物活性肽是用人体所需要的食品级植物蛋白酶，将人体平常所食的食物蛋白质酶解成小分子活性多肽。它具有极强的生物活性和多样性[3-4]。

超声波特有的空化作用以及机械振动、化学效应、扩散和乳化作用等可以加速细胞内有效成分的扩散释放，从而提高提取率[5-6]。

食品保藏时每增加一个栅栏因子，就可以有保藏加和作用，使保藏效果更好，应用多种因子的条件都比单一因子要温和，这种保藏技术称为栅栏技术[7]。本试验采用超声波-复合酶耦合处理花生粕，制备花生粕抗氧化肽，并研究了其清除多种自由基的能力，为花生粕的综合利用提供了科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

FeSO4、TCA、无水乙醇、TBA、CuSO4、牛血清蛋白（分析纯）等：上海国药集团；木瓜蛋白酶1.0×105U/g、中性蛋白酶 1.5×105U/g、碱性蛋白酶 1.0×105U/g、酸性蛋白酶 1.5×105U/g、胰蛋白酶 1.5×105U/g：无锡市雪梅酶制剂科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：SIGMA公司。

PHS-3CA精密酸度计、7230G可见分光光度计型：上海精密科学仪器有限公司；KS-900C型超声波细胞粉碎机：上海比朗仪器有限公司；RE-52A型旋转蒸发器：上海申生科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 超声波提取花生粕抗氧化肽

在超声时间为2 s，间隔时间为2 s，超声功率为300 W，处理总时间为10 min的条件下，提取花生粕中抗氧化肽。

1.2.2 酶种类的确定

称取花生粕置于三角瓶中，分别取酸性蛋白酶，碱性蛋白酶，中性蛋白酶，胰蛋白酶，木瓜蛋白酶，酶底比为 2∶1（mg/g）加入 100 mL 水，在温度为 45 ℃，自然pH值下酶解3 h，离心，取上清液在100℃的沸水中灭酶3 min，测花生粕抗氧化肽的含量。

1.2.3 复合酶比例的确定

在酸性蛋白酶，碱性蛋白酶，中性蛋白酶，胰蛋白酶，木瓜蛋白酶中，选出酶解效果最好的3种，两两复配，比例分别设为 1∶1、1∶2、1∶3、3∶1、2∶1（质量比），酶底比为 2∶1（mg/g），加入 200 mL 水，在温度为 45 ℃，酶解时间为3 h，自然pH值下酶解3 h，离心，取上清液在100℃的沸水中灭酶3 min，测花生粕抗氧化肽的含量。

1.2.4 超声波-复合酶耦合提取花生粕抗氧化肽单因素试验

1.2.4.1 超声波功率的影响

称取花生粕置于三角瓶中，酶底比为2∶1（mg/g）的组合酶，底物浓度8%，pH7.7，超声时间2 s，间隔时间2 s，超声处理总时间为5 min，分别在超声波功率为50、100、150、200、250、300 W，45 ℃下酶解 1.5 h，离心，上清液灭酶，测花生粕抗氧化肽含量、DPPH自由基清除率。

1.2.4.2 超声时间的影响

称取花生粕置于三角瓶中，酶底比为2∶1（mg/g）的组合酶，底物浓度8%，pH7.7，超声波功率150 W条件下，超声时间2 s，间隔时间2 s，分别在超声处理总时间为 1、3、5、7、9、11 min，45 ℃下酶解 1.5 h，离心，上清液灭酶，测花生粕抗氧化肽含量、DPPH自由基清除率。

1.2.4.3 酶解温度的影响

称取花生粕置于三角瓶中，酶底比为2∶1（mg/g）的组合酶，底物浓度8%，pH7.7，在超声时间为2 s，间隔时间为2 s，超声功率为150 W，处理总时间为5 min，分别在 35、40、45、50、55 ℃下酶解 1.5 h，离心，上清液灭酶，测花生粕抗氧化肽含量、DPPH自由基清除率。

1.2.4.4 酶解时间的影响

称取花生粕置于三角瓶中，酶底比为2∶1（mg/g）组合酶，底物浓度8%，pH7.7，在超声时间为2 s，间隔时间为2 s，超声功率为150 W，处理总时间为5 min，45℃下分别酶解 0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5 h 下酶解，离心，上清液灭酶，测花生粕抗氧化肽含量、DPPH自由基清除率。

1.2.5 超声波-复合酶耦合提取花生粕抗氧化肽正交试验

根据单因素试验，以酶解时间（h）、超声时间（s）、超声波功率（W）、酶解温度（℃）为因素，进行四因素三水平的正交试验。因素与水平见表1。

表1 正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.6 花生粕抗氧化肽含量测定

采用双缩脲[8]法。

1.2.7 测定DPPH自由基的清除能力

用分光光度法[8]测定。清除率SA可表示为：

式中：A0为DPPH与溶剂混合液的吸光度；Ai为DPPH与样品反应后的吸光度，Aj为样品与溶剂混合液的吸光度。

1.2.8 测定羟基自由基的能力清除

采用硫酸亚铁法[9]，清除率P可表示为：

式中：A0为空白吸光度；Ai为样品吸光度。

1.2.9 测定脂质过氧化物清除能力

采用硫代巴比妥酸法[10]，清除率I可表示为：

2 结果分析

2.1 不同种类酶对花生粕抗氧化肽提取的影响

不同种类酶对花生粕抗氧化肽提取效果的影响见图1。

图1 不同种类酶对花生粕抗氧化肽提取效果的影响Fig.1 Influence of different enzymes to extractive impact of peanut meal anti-oxidation peptide

如图1所示，水解效果最好的酶依次为中性蛋白酶＞碱性蛋白酶＞胰蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞酸性蛋白酶，所以选择碱性蛋白酶，中性蛋白酶两两复配。

2.2 复合酶比例对花生粕抗氧化肽提取的影响

复合酶不同比例对花生粕抗氧化肽提取效果的影响见图2。试验结果表明，在碱性蛋白酶和中性蛋白酶的比例为3∶1（质量比）时，酶解效果最好，花生粕抗氧化肽含量达到6.547mg/mL。

图2 复合酶不同比例对花生粕抗氧化肽提取效果的影响Fig.2 Influence of diffent complex enzyme scale to extractive impact of peanut meal anti-oxidation peptide

2.3 底物浓度对花生粕抗氧化肽提取效果的影响

当底物浓度不足时，反应体系中会剩余一部分酶没有结合底物，没有发挥催化作用，当所有酶都结合底物后，底物浓度再加大，酶的反应体系中没有多余的酶进行催化作用，反应速度达到了饱和状态，酶解产生的花生粕抗氧化肽也不会再增加[12]。底物浓度对花生粕抗氧化肽提取的影响见图3。由图3可以看出，底物浓度从1%到8%，花生粕抗氧化肽含量、DPPH自由基清除率均呈上升趋势。

图3 底物浓度对花生粕抗氧化肽提取的影响Fig.3 Influence of different substrate concentration to extractive impact of peanut meal anti-oxidation peptide

2.4 酶底比对花生粕抗氧化肽提取效果的影响

酶底比对花生粕抗氧化肽提取的影响见图4。

图4 酶底比对花生粕抗氧化肽提取的影响Fig.4 Influence of different enzyme and substrate to extractive impact of peanut meal anti-oxidation peptide

由图4可以看出，随着酶底比的增加，花生粕抗氧化肽的多肽含量及DPPH自由基清除率均在一定范围内呈上升趋势，但到达一定浓度后，酶分子在体系中趋于饱和，部分酶分子不能和底物接触，酶解效果趋于稳定[13]，酶底比对花生粕抗氧化肽提取效果的影响就不再增大。

2.5 超声波功率对花生粕抗氧化肽提取效果的影响

超声波功率对花生粕抗氧化肽提取的影响见图5。

试验结果表明：超声功率太小时，对细胞壁的破碎程度不足，造成多糖不能快速有效地溶出，随着功率的提高，这种增溶作用也随之明显，但超声功率过大也会造成原料在超声场中停留时间过短，破壁作用减弱，而且可能造成反应器内局部温度瞬时升高，从而破坏花生粕抗氧化肽的结构，降低花生粕抗氧化肽的提取率及DPPH自由基清除率[14]，综合考虑选择超声波功率150 W。

图5 超声波功率对花生粕抗氧化肽提取的影响Fig.5 Influence of different ultrasonic power to extractive impact of peanat mcal anti-oxidation peptide

2.6 超声时间对花生粕抗氧化肽提取效果的影响

超声时间对花生粕抗氧化肽提取的影响见图6。

图6 超声时间对花生粕抗氧化肽提取的影响Fig.6 Influence of different ultrasonic time to extractive impact of peanat mcal anti-oxidation peptide

超声波处理时间越长，超声波对物料的作用越充分，水溶性成分浸出率越高，当达到一定时间后，溶液体系渗透压达到平衡，浸出率趋于平稳。考虑生产周期等方面，超声时间选择5 min。

2.7 温度对花生粕抗氧化肽提取的影响

化学反应中，升高反应体系的温度，可以增加反应物的能量，从而加大反应物分子间有效的接触频率，因而加快了反应的速度。而每种酶都有其最佳的作用温度，当作用温度超过其最适温度后，酶分子的空间结构会改变，酶蛋白质发生变性，造成酶活力减弱至完全丧失活力，酶促反应的速度也会迅速下降[15]。温度对花生粕抗氧化肽提取的影响见图7。

图7 温度对花生粕抗氧化肽提取的影响Fig.7 Influence of the temperature to extractive impact of peanat mcal anti-oxidation peptide

从图7可以看到，温度从30℃到45℃，提取液中花生粕抗氧化肽含量及DPPH自由基清除率均上升，此后，随着温度的上升，花生粕抗氧化肽含量及DPPH自由基清除率均下降。

2.8 酶解时间对花生粕抗氧化肽提取的影响

酶解反应时间对酶解进行程度有重要的影响，因为蛋白酶的水解反应是逐步进行的，如果反应时间太短，则酶解不充分，而当酶浓度达一定值时，所有酶都能结合底物而参与反应，此时再延长酶促反应时间，并不能显著增加花生粕抗氧化肽的提取量[15]。酶解时间对花生粕抗氧化肽提取的影响见图8。

从图8可以看到，酶解反应从0.5 h到1.5 h，提取液中花生粕抗氧化肽含量及DPPH自由基清除率是上升的，在1.5 h达到最大值。

图8 酶解时间对花生粕抗氧化肽提取的影响Fig.8 Influence of the time to extractive impact of peanat mcal anti-oxidation peptide

2.9 超声波-复合酶耦合提取花生粕抗氧化肽正交试验

根据以上单因素试验结果，以酶解温度、酶解时间、底物浓度、酶底比进行四因素三水平正交试验，结果见表2。

表2 正交试验结果Table 2 Results of orthogonal test

由表2可知，超声波-复合酶耦合提取花生粕抗氧化肽最佳组合为A2B2C2D2、A2B2C2D3，通过验证试验得出A2B2C2D2即酶解温度为45℃，酶解时间为1.5 h，超声波功率为150 W、超声处理时间120 s为最佳提取条件，此时花生粕抗氧化肽含量7.01 mg/mL，DPPH自由基清除率达到89.22%。

2.10 抗氧化性研究

2.10.1 DPPH自由基清除率测定

DPPH自由基清除率测定见图9。

试验结果表明，在一定范围内，3种方法提取制备的花生粕抗氧化肽含量对DPPH自由基的清除效果均呈线性关系，其相关系数R2分别达到0.9175、0.9518、0.902 1，花生粕抗氧化肽对DPPH自由基的半数清除率分别为 2.41、3.75、2.85 mg/mL。

图9 不同提取方法提取液的DPPH自由基清除率Fig.9 DPPH·clearance rate of different methods

2.10.2 脂质过氧化物清除率测定

脂质过氧化物清除率测定见图10。

图10 不同提取方法提取液的脂质过氧化物清除率Fig.10 Lipid peroxidation clearance rate of different methods

试验结果表明，在一定范围内，3种提取方法制备的花生粕抗氧化肽对脂质过氧化物的清除效果均呈线性关系的，其相关系数R2分别为0.904 4、0.946 5、0.869 9。花生粕抗氧化肽对脂质过氧化物的半数清除率分别为 2.91、3.3、4.04 mg/mL。

2.10.3 羟基自由基清除率测定

羟基自由基清除率测定见图11。

图11 不同提取方法提取液的羟基自由基清除率Fig.11 Hydroxyl radicals clearance rate of different methods

试验结果表明，在一定范围内，3种提取方法制备的花生粕抗氧化肽对羟基自由基的清除效果均呈线性关系，其相关系数R2分别为0.944 2、0.966 5、0.932 6。花生粕抗氧化肽对羟基自由基的半数清除率分别为 2.975、3.67、3.76 mg/mL。

2.10.4 不同提取方法对花生粕抗氧化肽提取效果的比较

不同提取方法对花生粕抗氧化肽提取效果的比较见图12。

图12 不同提取方法对花生粕抗氧化肽提取效果的比较Fig.12 Compared of different methods to extractive impact of peanut meal anti-oxidation peptide

超声波-酶耦合提取法结合了超声波和复合酶的优点，属于栅栏技术处理，处理程度低于单一的超声波处理和复合酶处理，提取效果则最佳。比单一超声波处理和复合酶处理提取液中花生粕抗氧化肽含量高21.65%、43.34%。

本试验采用超声波提取法、复合酶提取法及超声波-复合酶耦合提取法制备花生粕抗氧化肽，分别测定其清除醇溶性自由基（DPPH自由基）、水溶性自由基（羟基自由基）和脂溶性自由基（脂质过氧化物）这3种自由基的能力，试验结果表明，通过比较3种自由基的半数清除率可知，3种不同的方法制备的花生粕抗氧化肽均具有一定的抗氧化能力，超声波-酶耦合法制备的花生粕抗氧化肽对3种自由基清除能力均最好，且清除醇溶性自由基的能力最强。

3 结论

本试验采用中性蛋白酶：碱性蛋白酶=3∶1，酶底比2∶1（mg/g），底物浓度 8%的条件下，酶解温度为 45 ℃，酶解时间为1.5 h，超声波功率为150 W、超声处理时间5 min为最佳提取条件，此时花生粕提取液中多肽含量7.01 mg/mL，DPPH自由基清除率达到89.22%。超声波-酶法耦合法提取条件温和、制备的花生粕抗氧化肽含量高，有较强的抗氧化性，且醇溶性自由基DPPH自由基清除效果最好，是一种较好的常温下提取制备花生粕抗氧化肽的方法。

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Study on Preparation of Anti-oxidation Peptides with Ultrasonic-complex Enzyme from Peanut Meal

MA Li-hua，SONG Hui，CHEN Xue-hong，CHEN Duo
（Department of Food，Engineer College of Xuzhou，Xuzhou 221008，Jiangsu，China）

Peanut meal antioxidant peptide content and DPPH free radical clearance rate as the index，the effects of different enzymolysis time，ultrasonic treatment time，ultrasonic power and enzymolysis temperature on the extraction of antioxidant peptides from peanut meal were investigated.The scavenging effects of antioxidant peptides from peanut meal on 3 free radicals were studied.The results showed that the optimal extraction conditions were：concentration of substrate 8% ，ultrasonic power150 W，ultrasonic time 5 min，enzymolysising time1.5 h，enzymolysising temperature 45℃.Under this condition polypeptide content was 7.01 mg/mL，DPPH·clearance rate was 89.22%.The peanut meal polypeptide prepared by ultrasonic and complex enzyme coupling method had strong scavenging ability to 3 kinds of free radicals，and the ability to remove alcohol soluble free radicals was strongest.

peanut meal peptides；ultrasonic-complex enzyme；extracting；anti-oxidation

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.17.014

2016-12-06

马利华（1966—），女（汉），教授，硕士研究生，研究方向：农产品贮藏与加工。