三元离子缔合物测定牛奶中的四环素残留

单展，范晶晶，马小龙，唐宁莉

1(桂林理工大学 化学与生物工程学院，广西 桂林， 541004) 2(桂林理工大学 广西高校食品安全与检测重点实验室，广西 桂林,541004)

分析与检测

三元离子缔合物测定牛奶中的四环素残留

单展1，范晶晶1，马小龙1，唐宁莉*

1(桂林理工大学 化学与生物工程学院，广西 桂林， 541004) 2(桂林理工大学 广西高校食品安全与检测重点实验室，广西 桂林,541004)

在醋酸溶液中，四环素(tetracycline，Tc)与Cu2+形成螯合阳离子，然后进一步与带负电荷的铬天青S通过静电引力形成三元离子缔合物，导致反应体系的共振散射信号增强，据此建立了一种测定痕量Tc的共振散射光谱新方法。在最佳条件下，波长700 nm处，Tc浓度与体系共振散射强度的增加值(ΔI)在0.2～22 μmol/L呈良好的线性关系，其线性回归方程为：ΔI=1.021×107c+1.437(c为Tc的浓度，mol/L)，方法的检出限为8.81×10-9mol/L，相关系数r=0.999 0。将该方法应用于牛奶样品中Tc的测定，回收率为100.00%～101.20%。

铬天青S；四环素；牛奶；共振散射

四环素(tetracycline，Tc)是一种具有广谱抗菌活性的抗生素，可作为预防和治疗禽畜疾病的兽药或作为饲料添加剂应用于动物饲料中。近年来，随着我国禽畜养殖业的规模化发展，残留的四环素对环境和人类健康构成了巨大的潜在危险和威胁。因此四环素的痕量分析对于环境监管和食品监管部门是非常重要的工作。目前，测定Tc的主要方法有高效液相色谱法及其联用技术[1-2]、毛细管电泳、酶联免疫分析法[3]、紫外-可见分光光度法[4-5]、荧光光度法[6-7]、共振散射法[8-9]等。

共振散射光谱法(resonance light scattering，RLS)具备简易、灵敏、快速和成本低的优点，近年来被广泛应用于检测痕量金属离子、生物大分子和药物。但目前应用共振散射光谱技术定量检测四环素的研究较少。本研究利用四环素分子中C11、C12位上的β-二酮结构与金属离子Cu2+形成二元阳离子，然后二元阳离子进一步与带负电荷的铬天青S通过静电引力形成三元离子缔合物，导致反应前后体系的共振散射强度发生变化，从而建立测定四环素的共振散射光谱新方法，进一步提高了方法的灵敏度和选择性，并用实验验证了反应机理。

1 实验部分

1.1仪器与试剂

Cary Eclipse型荧光光度计，美国Varian；ZS90型纳米粒度与Zeta电位分析仪,英国Malvern公司；pHS-3C型精密pH计,上海雷磁仪器厂。

四环素标准溶液(Tc，90%，美国Amresco公司)：1.0×10-3mol/L的Tc储备液，Tc工作液(1.0×10-4mol/L)由储备液稀释得到；Cu2+溶液(1.0×10-2mol/L)，由CuSO4(广州化学试剂厂)配制；铬天青S溶液(CAS，1.2×10-3mol/L),上海试剂三厂;HCl、H2SO4、HAc溶液(5.0×10-5mol/L),广东汕头市西陇化工股份有限公司。

实验用水均为二次去离子水，所用试剂均为分析纯。盒装鲜牛奶样品，购于当地超市。

1.2实验方法

在10 mL的比色管中，分别加入5.0×10-5mol/L的HAc溶液0.5 mL，1.0×10-2mol/L的Cu2+溶液1.0 mL，1.2×10-3mol/L的CAS溶液1.0 mL和一定量的Tc工作液(以不加Tc的溶液为试剂空白)，加水稀释至10 mL，摇匀，25 ℃反应10 min后，在荧光光度计上以λex=λem方式进行同步扫描，记录波长700 nm处加有四环素标准溶液的RLS强度I和试剂空白的RLS强度I0，并计算RLS强度差值ΔI=I-I0。

2 结果与讨论

2.1体系的共振散射光谱

按照实验方法扫描了体系不同组合的RLS光谱，结果如图1所示。在HAc溶液中，Cu2+、CAS、Tc的两两反应产物(图1中的a～c)的RLS强度均较弱，但当三者共存时，体系的RLS强度随Tc的加入量增大而增强(图1中的d和e)，同时在700 nm处具有最强的RLS峰，由此可见三者结合生成三元离子缔合物导致体系的RLS强度增强。

a:四环素与铜离子混合溶液；b:四环素与铬天青S混合溶液；c:铬天青S与铜离子混合溶液；d-e:铬天青S与铜离子及四环素混合溶液四环素的浓度: 1.0×10-5 mol/L(a,b,e); 5.0×10-6 mol/L (d)图1 体系的共振散射光谱Fig.1 Resonance light scattering spectra of the systems

2.2实验条件的选择

2.2.1 反应介质的选择

按实验方法分别考察了HCl、H2SO4、HAc三种溶液不同浓度下体系的ΔI值，结果表明,在HAc溶液中体系的ΔI值较大且重现性好，说明体系在弱酸介质中比较稳定。实验发现，体系在0.5 mL的5.0×10-5mol/L的HAc溶液中ΔI值最大，灵敏度最高，故选择5.0×10-5mol/L的HAc溶液作为最佳反应介质，用量为0.5 mL。

2.2.2 CuSO4用量的选择

在0.2～1.0 mL内，随着CuSO4用量的增加，Cu2+开始与Tc结合形成螯合物，体系的ΔI值不断增大。当CuSO4的用量为1.0 mL时，体系的ΔI值达到最大；当CuSO4的用量超过1.0 mL后，体系的ΔI值逐渐下降，故选择1.0×10-2mol/L CuSO4的用量为1.0 mL。

2.2.3 铬天青S用量的选择

当铬天青S的用量为1.0 mL时，体系的ΔI值达到最大；铬天青S的用量过多或过少都会使体系的ΔI值下降，故选择1.2×10-3mol/L铬天青S的用量为1.0 mL。

2.2.4 反应时间的选择

在室温条件下，体系反应5 min即可反应完全，在3 h内体系的ΔI值基本保持稳定。为了便于实验操作，实验选择在反应10 min后进行测定。

2.2.5 反应温度的选择

在10～25 ℃内，随着温度升高，体系ΔI值逐渐增大；当温度达到25 ℃时，体系ΔI值最大；25 ℃后随着温度继续上升，体系ΔI值下降。原因可能是温度过高，破坏了体系之间的静电引力作用，从而导致体系的RLS强度减弱，ΔI值下降。故选择25 ℃作为反应温度。

2.2.6 试剂加入顺序的选择

当试剂加入顺序为Tc-Cu2+-HAc-CAS时，体系的ΔI值较其他加入顺序的ΔI值大，故选择最佳的试剂加入顺序为：Tc-Cu2+-HAc-CAS。

2.3工作曲线和方法的检出限

在最优的实验条件下，按照实验方法检测λ=700 nm处不同浓度四环素标准的RLS强度，Tc浓度在0.2～22 μmol/L内与ΔI呈良好的线性关系，线性回归方程为：ΔI=1.021×107c+1.437，c为Tc的浓度，单位为mol/L，相关系数r=0.999 0。按实验方法平行测定空白13次，标准偏差S=0.03，根据DL=3S/K(K为回归方程的斜率)，求得检出限为8.81×10-9mol/L。

2.4干扰物质的影响

当Tc浓度为4.3 μg/mL时，考查了可能存在的干扰物质对测定结果的影响，当相对误差≤±5%时，共存物质的允许量为(μg/mL)：蔗糖(860)；K+(430)；Ca2+(340)；Na+(300)；NH4+(250)；葡萄糖、淀粉和L-精氨酸(210)；Mg2+、NO3-、SO42-和L-天冬氨酸(130)；L-酪氨酸(90)；DL-半胱氨酸和甘氨酸(60)。Fe2+(2.6)、Fe3+(3.4)、Al3+(5.1)干扰比较大，可加入EDTA进行掩蔽。

2.5样品测定

在当地超市购买蒙牛、伊利纯牛奶作为样品。准确量取5.0 mL牛奶样品置于100 mL离心管中，加入50 mL乙酸盐缓冲液-乙腈混合溶液(体积比1∶4)，振荡摇匀5 min，5 000 r/min离心20 min除去蛋白质。取上清液至分液漏斗中，加入25 mL正己烷，振荡摇匀5 min，静置分层后弃去正己烷层。吸取下层清液，用正已烷反复脱脂至澄清，待用[10]。取一定体积的样品待测液，按照实验方法测定其共振散射强度，未检出四环素。为考察实验方法的可行性，进行加标回收实验(表1)。由表中可以看出本方法的加标回收率为100.00%～101.20%，结果令人满意。

3 反应机理探讨

3.1表面活性剂的影响

在体系中分别加入了阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵(CTMAB)、 阴离子表面活性剂十二烷基苯磺酸钠(DBS) 和非离子表面活性剂阿拉伯胶(AG)，观察体系RLS强度的变化情况。实验结果表明，当体系中加入CTMAB后，空白体系的RLS强度I0值随CTMAB的加入量增加而增大，同时加入Tc标准溶液的反应体系的RLS强度I值也随CTMAB的加入量增加而增大，且CTMAB加入量相同条件下I值要比I0值大，说明带正电荷的CTMAB、Tc与Cu2+形成的二元阳离子同时与带负电荷的CAS发生静电引力作用，导致体系的I0、I值均增大。当体系中加入DBS后，空白体系I0随DBS的加入量增加基本不变，表明带负电荷的DBS与带负电荷的CAS不发生反应；而当体系中加入一定量Tc标准溶液后，I值随DBS的加入量增加而增大，且I值大于I0值，说明带负电荷的DBS、CAS同时与带正电荷的Tc与Cu2+形成的二元阳离子作用从而使反应体系I值增大。当体系中加入AG后，空白体系的I0和加入Tc标准溶液的反应体系的I值均随AG的加入量增加基本不变，说明AG与带负电的CAS和带正电的Tc与Cu2+形成的二元阳离子几乎都不反应。

表1 样品和回收率分析结果(n=5)

综上所述，可得出CAS同Tc与Cu2+形成的二元阳离子之间是通过静电引力结合形成离子缔合物的。

3.2粒径分析

a:铬天青S溶液；b:四环素与铜离子混合溶液；c:铬天青S与铜离子混合溶液;d-e:铬天青S与铜离子及四环素混合溶液四环素的浓度: 1.0×10-5mol/L(b,d); 1.5×10-5mol/L(e)图2 反应体系的粒径分析Fig.2 Particle size analysis of the reaction system

图2是反应物和产物的粒径分析图，由图2可知，CAS、CAS与Cu2+、Tc与Cu2+的平均粒径比较小，分别为134 nm、211 nm和247 nm(图2中的a、b和c)，当三者结合反应生成三元离子缔合物后，形成的产物的平均粒径明显增大，加入1.0×10-5mol/L Tc后，平均粒径约为619 nm(图2中的d)，加入1.5×10-5mol/L Tc后，平均粒径约为1 012 nm(图2中的e)，由此可见，三者结合反应后生成更大粒径的缔合微粒，这与RLS光谱结果相符合。

4 结论

本文研究了Tc-Cu2+-CAS三元离子缔合物反应的RLS光谱，发现三者结合导致体系RLS信号显著增强，且RLS强度增加值与Tc的浓度在0.2～22 μmol/L内成正比，据此建立了定量测定四环素的RLS新方法。该方法灵敏度高、选择性好，操作简便、快速，可应用于牛奶中Tc含量的测定。

[1] HUSSIEN E M. Development and validation of an HPLC method for tetracycline-related USP monographs[J]. Biomedical Chromatography, 2014, 28(9): 1 278-1 283.

[2] NEBOT C, GUARDDON M, SECO F, et al. Monitoring the presence of residues of tetracyclines in baby food samples by HPLC-MS/MS[J]. Food Control, 2014, 46: 495-501.

[3] CHEN Yan-ni, KONG De-zhao, LIU Li-qiang, et al. Development of an ELISA and immunochromatographic assay for tetracycline, oxytetracycline, and chlortetracycline residues in milk and honey based on the class-specific monoclonal antibody[J]. Food Analytical Methods, 2016, 9(4): 905-914.

[4] 倪永年, 邓娜, 周明. 动力学分光光度法测定药物中的四环素[J]. 南昌大学学报：理科版, 2010, 34(2): 142-144.

[5] TORAL M I, SABAY T, ORELLANA S L, et al. Determination of oxytetracycline from salmon muscle and skin by derivative spectrophotometry[J]. Journal of AOAC International, 2015, 98(3): 559-565.

[6] NANJUNDAIAH S, KRISHNA H, BHATT P. Fluorescence based turn-on probe for the determination of caffeine using europium-tetracycline as energy transfer complex[J].Journal of Fluorescence, 2016, 26(3): 1 115-1 121.

[7] WANG Zhuo-sen, LIN Jin-tai, GAO Jin-wei, et al. Two optically active molybdenum disulfide quantum dots as tetracycline sensors[J]. Materials Chemistry and Physics, 2016, 178: 82-87.

[8] LIU Xin, ZHANG Zi-long, PENG Jing-dong, et al. High-performance liquid chromatography with resonance Rayleigh scattering detection for determining four tetracycline antibiotics[J]. Analytical Methods, 2014, 6(23): 9 361-9 366.

[9] 陈粤华, 郝二军, 冯素玲, 等. 金纳米微粒共振瑞利散射光谱法测定四环素类抗生素[J]. 分析试验室, 2011, 30(4): 1-5.

[10] 毛永强, 梁密, 李宁, 等. 基于内滤效应荧光检测牛奶中土霉素含量[J]. 食品与发酵工业, 2015,41(5): 183-186.

Determinationoftetracyclineresiduesinmilkusingternaryion-associationcomplexes

SHAN Zhan1,FAN Jing-jing1,MA Xiao-long1,TANG Ning-li*

1(College of Chemistry and Biological Engineering, Guilin University of Technology, Guilin 541004, China) 2(Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of Food Safety and Detection, Guilin University of Technology，Guilin 541004,China)

In HAc solution, tetracycline(Tc) reacted with Cu2+to form cation chelates, which further reacted with chromeazurol S to form a ternary ion-association complexes. This enhanced resonance scattering signals. A new resonance light scattering method was established for the determination of trace Tc. Under the optimal conditions, the increase of the intensity(ΔI) at 700nm was linear to concentration of Tc in the range of 0.2-22 μmol/L. Its regression equation was ΔI=1.021×107c+1.437, with a correlation coefficient of 0.999 0 and a detection limit of 8.81×10-9mol/L. This method was applied in determination of Tc in milk samples with satisfactory results. The recovery was within the range of 100.00%-101.20%.

chromeazurol S; tetracycline;milk;resonance light scattering

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.013486

硕士研究生(唐宁莉教授为通讯作者，E-mail: ysshiyanshi@163.com)。

2016-11-25，改回日期：2017-01-03