超声处理对黑米酒中有机酸的影响

颜艳英，王袭，范学辉，张清安

(陕西师范大学 食品工程与营养科学学院，陕西 西安，710119)

超声处理对黑米酒中有机酸的影响

颜艳英，王袭，范学辉，张清安*

(陕西师范大学 食品工程与营养科学学院，陕西 西安，710119)

加速黑米酒的陈化是企业所面临的主要问题，已有研究表明超声可以加速酒类陈化，但关于超声对黑米酒中有机酸的影响未见报道。该研究通过利用高效液相色谱法检测在不同超声参数(功率、频率及时间)下黑米酒中5种有机酸的含量，并分析其变化规律。结果表明：超声波促使黑米酒中酒石酸、柠檬酸的含量减少；而草酸、乳酸、乙酸的含量增加。这些研究结果将为超声处理黑米酒的进一步优化提供依据，也为超声波早日应用在黑米酒陈化工艺中提供借鉴和理论依据。

超声波；黑米酒；有机酸；超声功率；超声频率；超声时间

使黑米酒具有酸性特征的有机酸类是黑米酒的主要组成成分。而有机酸主要是通过其种类、浓度及构成影响着酒样的酸性，进而影响黑米酒的风味。此外，有机酸对黑米酒的色、香、味也有着重要的影响[1-3]。酒类中有机酸大部分是来源于发酵过程中的生理生化反应，如乙醇发酵，乙醇的氧化反应，苹果酸乳酸发酵等。其中酒中的醋酸有刺激嗅觉神经，增加食欲，增强体魄的功效[1]；而乳酸、柠檬酸、酒石酸等能给酒类带来良好的风味，增加酒的醇厚感[2]。舒杰[3]利用超声破碎仪处理黄酒模型体系(主要以乙醇、主要挥发物质和有机酸建立的模型酒)，发现超声加速了模型酒中乳酸和乙醇的酯化反应，从而增加了黄酒的香气。申远[4]在不同超声参数(超声功率、频率、温度及时间)下处理红葡萄酒时发现乙酸、柠檬酸、琥珀酸、乙二酸、乳酸的含量都发生不同程度的改变，且变化基本符合红酒自然陈化过程中有机酸的变化趋势。因此，了解超声处理过程中黑米酒中有机酸的种类及含量的变化，对判定超声前后黑米酒的风味变化具有一定的实际意义。但在此之前，需要对超声波的实际功率进行深入的了解。

超声波作为一种新技术在食品工业中的应用越来越广泛，如超声提取、乳化、干燥、过滤、分离等[5-7]。但是在应用过程中经常被研究者忽略的问题是：将超声池清洗仪上标识的电功率误认为是超声池的实际功率进行讨论分析，导致实验结果、数据很难重复，且不同研究之间的实验数据很难相互比较[8-11]。因此，在讨论超声波对黑米酒中有机酸的影响之前，需要对超声清洗池的实际功率进行测量，筛选出超声效果较好的超声参数。超声波的实际功率表达形式有多种，通常探头式的超声波利用声能(W/cm2)表示，而超声波清洗仪通常使用声功率密度(W/L)来表示[12]。

本文通过量热法计算超声清洗仪在不同功率频率下的实际声功率密度[12-15]，筛选出声功率密度变化明显的超声参数；并采用反向高效液相色谱法，测定超声处理后黑米酒中草酸、乳酸、乙酸、酒石酸及柠檬酸的含量，进而利用声功率密度来代替电功率分析超声对黑米酒中有机酸的影响。

1 实验材料、试剂与设备

1.1实验材料与试剂

陶瓷坛贮存3年的黑米酒样品：陕西省朱鹮黑米酒有限责任公司提供。

磷酸：分析纯，天津市广成化学试剂公司；磷酸二氢钾：分析纯，天津市天力化学试剂有限公司；草酸(99.8%)、酒石酸(99.5%)、乳酸(90%)、乙酸(99.8%)、柠檬酸(99.8%)：优级纯，中国食品药品检定研究所。

1.2实验设备

数控超声波清洗机(KQ-300VDE)，江苏省昆山市超声仪器有限公司；温度采集器(M5000-AS32)，北京安伏电子技术有限公司；温度在线监测系统(Anyview6)，北京安伏电子技术有限公司；低温冷却液循环泵(DLSB-5Z20)，上海翔雅仪器设备有限公司；电子分析天平(BS200S-WEI)，北京赛多利斯科学仪器有限公司；精密酸度计(PHS-3C)，上海仪电科学仪器股份有限公司；循环水式多用真空泵(SHB-III)，郑州长城科工贸有限公司；紫外-可见检测器(UV230II)，大连伊利特分析仪器有限公司；色谱柱温箱(ZW230II)，大连伊利特分析仪器有限公司；高压恒流泵(P230II)，大连伊利特分析仪器有限公司；反相液相色谱柱(TC-C18)，安捷伦科技有限公司。

2 实验方法

2.1超声波清洗仪的实际声功率密度的计算

超声波清洗池周围用泡沫板包裹，减少热量散失，超声池内水位固定为100 mm，将温度探头固定至超声池中间位置不变，并且使探头距离超声波换能器的高度为该条件下的半波长[9, 16]。利用低温冷却循环泵将超声池内水的初温控制在(20 ℃±1) ℃，随后在不同超声条件下超声20 min，计算温度变化量，并根据热量法公式稍加修改计算声功率密度[11, 17]。

(1)

式中：dT/dt，温度变化量；Cp，溶剂的比热容，J/(kg·K)；ρ，所用溶剂的密度，kg/L。

2.2黑米酒样品的超声处理过程

取适量的黑米酒于具塞试管中，固定在水位为100 mm的超声波清洗池中，每次固定的位置和高度(距离换能器的高度为超声波的半波长)不变。研究黑米酒在不同超声功率(120、180、240及300 W)、超声频率(45、80及100 kHz)和超声时间(20、40、60、80及100 min)下有机酸的变化。

2.3黑米酒中有机酸的测定

2.3.1 流动相的制备

精确称取23.12 g KH2PO4加入纯净水，定容于2 L容量瓶中(浓度为0.085 mol/L)，用磷酸调节酸度至pH值至2.90。流动相需经过0.45 μm无机纤维树脂滤膜过滤，并超声波脱气20 min后方可使用。

2.3.2 有机酸标准液的配制

准确称取(量取)5种有机酸，使用2.3.1中配置好的流动相溶解，然后定容至100 mL，有机酸标准溶液配制好后置于4 ℃冰箱中，待用。有机酸标准溶液浓度见表1，由于乳酸和乙酸为液体试剂，此处用称量法配制标准溶液可能会产生比较大的误差，故使用标准氢氧化钠溶液进行标定。

表1 有机酸标准溶液配制

2.3.3 高效液相色谱仪运行条件

色谱柱：反向液相色谱柱(安捷伦TC - C18，250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：2.3.1配制好的流动相；流速：0.60 mL /min；进样量：20 μL；检测器波长：210 nm；柱温：30 ℃。

2.4数据处理

以上测定均需重复进行3次，使用Microsoft Office Excel、DPS和主成分分析软件进行相关图表的绘制和数据处理。

3 结果与分析

3.1实际声功率密度

不同功率、频率下的实际声功率密度如表2。

表2 KQ-300VDE超声波清洗机的实际声功率密度 单位：W/L

注：同一行数据后大写字母表示在P<0.05 水平上的显著性差异，小写字母表示在P<0.05垂直上的显著差异。

超声频率是指每秒钟波反复变化的次数，而功率是指这种振荡所具有的能量。当功率不变频率不同时，所产生的的空化效应的强度也会不同(频率越高，周期就会越短，为空泡生长、爆破等空化过程提供的时间就不足，从而空化效应变弱)，从而实验结果可能不一样；当然，频率相同功率不同，由于所提供的能量不同，结果也是有区别的。

由表2可知，当超声频率不变的情况下，超声功率对声功率密度的影响并不显著，即该超声仪在改变超声功率时，其实际的超声作用并没有明显改变，这也可以解释为什么有的文章中提到的超声功率对反应的影响较微弱[18]。但也不能否认在45 kHz和100 kHz时声功率密度随超声功率的影响虽不显著却有上升的趋势。相对于功率，频率对声功率密度的影响十分显著，不同功率下声功率密度均在45 kHz时达到最大，其中，45 kHz，300 W时声功率密度达到最大，超声效果明显。但考虑到不同功率之间的显著性差异，当频率为100 kHz时P<0.05，因此，当探讨超声功率对有机酸的影响时，固定频率为100 kHz；300 W时超声波清洗仪的声功率密度相对较大，超声效果较为明显，因此，当分析超声频率对有机酸的影响时，固定功率为300 W。

3.2超声功率对黑米酒中有机酸的影响

草酸、乳酸、乙酸、酒石酸及柠檬酸的标准HPLC色谱图如图1，标准曲线方程、相关系数、检出限及定量限如表3。

1-草酸；2-酒石酸；3-乙酸；4-乳酸；5-柠檬酸图1 5种有机酸标准HPLC色谱图Fig. 1 Standard HPLC chromatogram of five organic acids

表3 5种有机酸的标准曲线方程与相关系数

当超声频率为100 kHz，超声时间为20 min时，不同超声功率对黑米酒中五种有机酸的影响如图2。由图2可知超声后草酸、乳酸的含量变化并不十分显著(P>0.05)，但都略有增加，而乙酸发生了显著性增加(P<0.05)，3种酸在300 W(23.00 W/L)时含量均达到最大，分别为0.40、9.43及14.53 g/L。结合表2的声功率密度对其进行主成分分析(PCA)如图3，可知草酸、乳酸和乙酸同声功率密度呈正相关。而酒石酸和柠檬酸的含量随着声功率密度的增加呈现先减少后增加的趋势，当声功率密度达到23.00 W/L时，虽有所降低，但与未处理的含量无显著差异，酒石酸在20.67 W/L时含量最低为0.43 g/L，降低了29.5%。柠檬酸在超声后含量显著下降，当声功率密度为16.36 W/L时，柠檬酸含量减少量最多为0.99 g/L，降低了36.17%，柠檬酸的含量虽然随着声功率密度的增加也在不断的回升，但仍没有超过未超声的含量。通过主成分(PCA)分析可知，酒石酸、柠檬酸与声功率密度呈负相关，即超声后酒石酸和柠檬酸的含量都有不同程度的下降。

柱图从左至右依次为：草酸、乳酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸图2 超声功率对黑米酒中有机酸含量的影响Fig.2 Effect of ultrasonic power on organic acids of black rice wine

图3 不同功率超声波处理后样品差异的主成分(PCA)分析图Fig.3 PCA scores and loadings for PC1 and PC2 of ultrasonic power on physicochemical properties of black rice wine

3.3超声频率对黑米酒中有机酸的影响

如图4所示，超声功率(300 W)和超声时间(20 min)不变，不同超声频率处理后黑米酒中除了草酸无显著性变化外，乳酸、酒石酸、乙酸及柠檬酸含量均发生显著变化。其中，乳酸和乙酸含量显著增加，比较不同超声频率处理后酒样，发现当超声频率为45 kHz、声功率密度为52.27 W/L时，酒样中的乳酸和乙酸含量达到最大，分别为10.94 g/L、17.11 g/L；在80 kHz (24.08 W/L)和100 kHz (23.00 W/L)时乳酸与乙酸的含量均下降，但80 kHz时乳酸和乙酸含量的变化与100 kHz时的变化无显著性差异，联系声功率密度可知，24.08 W/L与23.00 W/L之间差异性很小，从而导致乳酸和乙酸的含量在80 kHz及100 kHz时无显著性差异。与乳酸和乙酸不同，酒石酸和柠檬酸在超声后含量均显著性下降，在45 kHz(52.27 W/L)时达到最低分别为0.48 g/L、1.39 g/L。从超声波的空化效应及机械剪切两方面进行探讨。一方面，当超声达到一定能量时，液体中的微小泡核被激活，表现为振荡和生长，但只有当超声频率与空化气泡的自然共振频率相等时，才能达到最有效的能量耦合，从而使得空化气泡崩溃，产生的瞬时的高温、高压，作用于溶液中的分子，使其裂解[19]；另一方面，超声处理使液体分子携带高能运动，且具有较高的能量，液体介质对物质的剪切力就会增大[20]。另外，超声波频率越低，其剪切作用越强；频率越高，其声化学效应越强，产生的自由基越多[21]。因此，超声波处理可能将有机酸分子从酯类化合物中释放出来，同时由于超声处理，分子运动加快，也会使挥发性有机酸挥发。

柱图从左至右依次为：草酸、乳酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸图4 超声频率对黑米酒中有机酸含量的影响Fig.4 Effect of ultrasonic frequency on organic acids of black rice wine

3.4超声时间对黑米酒中有机酸的影响

图5显示，在不同超声时间(固定超声功率、频率分别为300 W、100 kHz，声功率密度为23.00 W/L)处理后，整体上草酸和乳酸无显著变化；柠檬酸含量显著降低；乙酸含量先增加后下降；而酒石酸呈现先下降后增加的趋势。酒样在超声处理100 min后，柠檬酸含量降到最小，降低了12.9%；而乙酸在超声20 min时达到最大为14.53 g/L；酒石酸含量在超声60 min时含量最低，下降约36.0%。5种酸的含量在80 min和100 min处理后无明显差异，与未处理酒样相较，乳酸、草酸及乙酸无明显差异，酒石酸和柠檬酸显著降低，而在超声20 min时五种酸均呈现显著性变化，草酸、乳酸及乙酸显著增加，而酒石酸、柠檬酸显著下降。结合自然陈酿及超声波处理黄酒中有机酸含量变化的相关研究，黄酒在储存过程中，大量的醇类、醛类发生了氧化反应，因此酒中有机酸含量增加，但随着时间的延长，酒中酸类物质与醇类结合生成酯类导致酸类下降，同时，柠檬酸-乳酸发酵过程中柠檬酸经脱羧作用转化为乳酸和二氧化碳，柠檬酸含量下降，乳酸含量增加，而超声过程中有机酸的变化也都符合陈化规律[3, 22-23]。

柱图从左至右依次为：草酸、乳酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸图5 不同时间下超声波处理黑米酒中有机酸含量变化Fig.5 The influence of ultrasonic time on organic acids of black rice wine

4 结论

综合上述的讨论与分析，超声处理对黑米酒中5种有机酸含量的影响比较明显，从有机酸含量的变化趋势看：超声诱导黑米酒中酒石酸、柠檬酸含量减少，草酸、乳酸、乙酸含量增加；而不同超声处理条件(功率、频率、时间)对黑米酒中5种有机酸的影响不尽相同，其中超声频率对黑米酒中乳酸、乙酸的影响最大(45 kHz下乳酸、乙酸含量达到最大值)；而当超声功率为120 W时，柠檬酸含量最低；超声时间对酒石酸的影响最大，在超声至60 min时酒石酸含量达到最低值。同时，文中通过测量计算超声清洗仪的声功率密度，筛选出超声效果明显的超声参数(100 kHz，300 W)，继而通过声功率密度分析超声促使有机酸变化的原因。当然，在实际声功率密度下我们只探讨了超声对酸类物质的影响，其他物质比如酚类、电导率、pH值等，还需要我们做进一步的研究探讨。

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Effectofultrasoundirradiationonorganicacidsinblackricewine

YAN Yan-ying,WANG Xi,FAN Xue-hui,ZHANG Qing-an*

(School of Food Engineering and Nutrition Sciences, Xi’an 710119, China)

Studies have shown that ultrasound can induce accelerated aging of wine, which is the most important problem for the black rice wine enterprise, but the effect of ultrasound on organic acids of black rice wine has not been reported. In this paper, the contents of 5 kinds of organic acids in black rice wine were measured by high performance liquid chromatography (HPLC) under different ultrasonic parameters (power, frequency and time). The results showed that the content of tartaric acid and citric acid decreased, and the content of oxalic acid, lactic acid and acetic acid increased under ultrasound irradiation. These results will provide a useful reference and theoretical basis for the further optimization of ultrasonic parameters in black rice wine, and for the early application of ultrasound in the process of black rice wine aging.

ultrasound; black rice wine; organic acid; ultrasonic power; ultrasonic frequency; ultrasonic time

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.013929

硕士研究生(张清安副教授为通讯作者,E-mail:qinganzhang@snnu.edu.cn)。

陕西师范大学2015年研究生培养创新基金资助项目(2015CXS027)；国家自然科学基金青年科学基金项目(31101324)；陕西省自然科学基金项目(2015JM3097)；西安市科技局技术转移促进工程项目(CXY1434(5))；中央高校基本科研业务费专项(GK201602005)

2017-01-23 改回日期：2017-03-23