代谢工程改造Escherichiacoli生产3-羟基丙酸

程秀丽，秦海彬，熊涛，牛坤*

1(浙江工业大学, 浙江省生物有机合成技术研究重点实验室，浙江 杭州，310014) 2(浙江工业大学, 生物转化与生物净化教育部工程研究中心，浙江 杭州，310014)

研究报告

代谢工程改造Escherichiacoli生产3-羟基丙酸

程秀丽1, 2，秦海彬1, 2，熊涛1, 2，牛坤1, 2*

1(浙江工业大学, 浙江省生物有机合成技术研究重点实验室，浙江 杭州，310014) 2(浙江工业大学, 生物转化与生物净化教育部工程研究中心，浙江 杭州，310014)

以提高3-羟基丙酸的产量为目标，对实验室构建的基因工程大肠杆菌进行改造，敲除形成副产物1,3-丙二醇的主要酶基因——乙醛脱氢酶基因yqhD，得到E.coliW3110ΔyqhD (pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh/pACYCDuet-tac-dhaB1-4)，该工程菌摇瓶发酵产量达到2.53 g/L，相比未敲除yqhD基因的菌株，产量提高了5.8倍。另外，敲除了甘油代谢途径中的抑制因子glpR基因，得到E.coliW3110ΔglpR(pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh/pACYCDuet-tac-dhaB1-4)，该工程菌摇瓶发酵产量达到2.86 g/L，相比未敲除glpR基因的菌株，产量提高了6.7倍。后经5 L罐发酵培养后，3-羟基丙酸的产量提升到15.4 g/L。该实验为进一步利用大肠杆菌工程菌发酵生产3-羟基丙酸提供了研究基础。

3-羟基丙酸；甘油代谢；基因敲除；重组大肠杆菌

随着石油资源的日渐减少及其导致的温室效应等环境问题日益严重，生物柴油应运而生。然而，生物柴油产业的迅速发展产生了大量副产物甘油，使得甘油的价格急剧下降[1]。许多研究者都致力于利用生物柴油产业中产生的大量甘油来生产高附加值的产品。因此，利用甘油生物转化为高附加值的生物化工产品已成为一个高度活跃的研究领域[2]。当前利用甘油为底物生产的下游产物主要有：1,3-丙二醇(1,3-propanediol, 1,3-PDO)、环氧氯丙烷、乙二醇、乳酸、二羟基丙酮及3-羟基丙酸(3-hydroxypropionic acid, 3-HP)等[3]。

3-HP是一种重要的平台化合物，是一种无色无味的油状液体，可与水、醇、醚等多种有机溶剂互溶。由于其具有羧基和羟基两种官能团，因而在化学反应中是多种化工原料的合成前体物质[4]，如脱水生成丙烯酸，氧化生成丙二酸，与醇脂化作用生成酯，还可以通过还原作用生成1,3- PDO等[5-6]。同时3-HP还可以用来生产可降解环保塑料及医用生物材料等[7]。基于3-HP在商业上的巨大开发价值，2004年8月美国能源部将3-HP列为当今世界上12种最具开发潜力的化工产品之一[8]。

3-HP的生物合成方法按照底物的不同，主要分为两种类型：分别以葡萄糖和甘油为底物[9-11]。由于甘油目前产能过剩，且合成3-HP的路径比较简单，近年来得到了广泛而深入的研究。采用大肠杆菌产3-HP 的代谢途径如图1所示[12]。

缩写：G-3-P， 甘油三磷酸；DHAP， 二羟丙酮磷酸；PEP， 磷酸烯醇丙酮酸图1 大肠杆菌利用甘油的部分代谢途径Fig．1 The partial pathways involved in the respiratory utilization of glycerol in E. coli

目前文献中对大肠杆菌重组发酵合成3-HP的研究主要集中在新型高活力的醛脱氢酶的筛选、甘油代谢途经改造和NAD+辅酶再生等方面[12-14]。CHU等[13]筛选到来源于钩虫贪铜菌 (Cupriavidusnecator) 的新型醛脱氢酶GabD4，同时敲除了E.coliW3110(DE3)基因组中合成乙酸的关键基因ackA-pta以及催化3-羟基丙醛 (3-hydroxypropionaldehyde，3-HPA)合成1,3-PDO的关键基因yqhD后，利用葡萄糖和甘油进行双底物发酵，3-HP的产量提高到71.9 g/L。

KIM等[14]筛选到来源于铜绿假单胞菌 (PseudomonasaeruginosaPSPA7_3072) 的半醛脱氢酶PSALDH，将其与短乳杆菌 (Lactobacillusbrevis) 的甘油脱水酶DhaB-DhaR共表达于E.coliBL21 (DE3)中构建重组菌株，又敲除了甘油竞争途径中合成3-磷酸甘油的glpK基因、甘油脱氢酶glpA基因和催化3-HPA合成1,3-PDO的yqhD基因，使3-HP产量达到57.3 g/L。

本研究以实验室构建的产3-HP的工程菌E.coliW3110 (pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh/pACYCDuet-tac-dhaB1-4)为出发菌株，拟通过控制甘油代谢途径，减少甘油抑制因子的抑制作用[12,15-16]，并阻断代谢过程中副产物1,3-PDO的形成途径，使3-HPA在醛脱氢酶的作用下更多的转化为3-HP。从而获得具有工业应用价值、性能优良的工程菌，进一步提高3-HP 的产量。

1 材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1 菌株与质粒

本实验所用质粒与菌株见表1。

表1 本研究中所用的菌株和质粒

1.1.2 试剂

Phamta super-Fidelity DNA polymerase购自诺维赞公司；限制性内切酶EcoRI、HindIII、XhoI、NcoI、NdeI 、TaqDNA聚合酶及T4DNA连接酶、IPTG均购自Thermo生物公司；卡那霉素、氯霉素、链霉素和氨苄青霉素购自北京Solarbio公司；DNA Marker、protein Marker和染色剂Gold View购自大连TaKaRa公司；质粒提取试剂盒及凝胶回收试剂购自杭州Axygen生物技术有限公司；PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；进口蛋白胨、进口酵母粉购自北京Oxoid公司；3-HP标准品购自上海百灵威化学技术有限公司，其他试剂均为市售分析纯试剂。

1.1.3 培养条件和菌株培养条件

LB培养基：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，调pH值7.0左右，根据需要加入相应抗生素。固体培养基则添加琼脂粉20 g/L。

初始发酵培养基：甘油 30 g/L，NaCl 1 g/L，MgSO4·7H2O 0.25 g/L，Na2HPO4·12H2O 22.7 g/L，KH2PO43 g/L，酵母膏4 g/L，(NH4)2SO43.2 g/L。121 ℃灭菌20 min，需添加氯霉素100 mg/L、链霉素100 mg/L、VB120.02 g/L，pH 7.0左右。

试管培养条件：单菌落接种到试管中，30 ℃(37 ℃)，200 r/min，培养过夜；摇瓶发酵培养条件：种子液接种摇瓶，37 ℃(28 ℃)，150 r/min，培养35 h；5 L罐发酵培养条件：种子液接种到发酵罐，37 ℃(28 ℃)，400 r/min，控制pH 7.0左右，培养45 h。

1.1.4 仪器和设备

PCR扩增仪，Biometra TProfessional standard 96 Gradient；全自动凝胶成像系统，Bio-Rad Moleculat Imager Gel DOCTM XR+；电转仪，BIO-RAD MicroPulser；台式高速离心机，Eppendorf AG 22331 Hamburg；高速冷冻离心机，BECKMAN COULTER Avanti J-26S XP；酶标仪，SpectraMax M5；高效液相色谱，Waters，Milford，USA。

1.2方法

1.2.1 线性打靶片段的获得

glpR基因敲除菌构建方法为：以E.coliK12-glpR::kan基因组DNA为模版，利用PCR扩增出glpR::kan打靶片段并进行纯化。同样，利用此方法得到yqhD的线性打靶片段。本实验所用引物如表2所示。

表2 本实验所用引物

1.2.2 电击感受态的制备及电转化方法

将辅助质粒pKD46转化入E.coliW3110，培养温度30 ℃，添加50μg/mL氨苄青霉素。大肠杆菌化学感受态、电转化感受态的制备参见《分子克隆实验指南》[17]。

1.2.3 工程菌的转化

产3-HP的大肠杆菌工程菌种的构建是利用同源重组的方法进行基因敲除来实现的[18-19]，以敲除菌株E.coliW3110ΔglpR构建为例，首先将glpR::kan打靶片段经电击转化(电击条件：2.5 kV/cm，2 mm电击杯)转化到工程菌E.coliW3110-pKD46的感受态细胞中，经过电转化的细胞在1 mL LB液体培养基37 ℃恒温培养1 h，再把培养液涂布在含有50 μg/mL卡那霉素的LB固体培养基37 ℃恒温培养12～16 h。

1.2.4 阳性转化子的鉴定

通过菌落PCR验证筛选出同源重组的工程菌，即Kan抗性基因经同源重组已整合到染色体上。将获得的E.coliW3110Δgene::kan制备成化学感受态；再将质粒pCP20转化到E.coliW3110Δgene::kan感受态中，涂布Amp抗性的LB固体培养基，30 ℃恒温培养16～24 h。挑取单菌落在kan平板上划线检测kan抗性是否消除；利用pCP20含有的温度敏感基因repA101(Ts)来消去该质粒，挑取在Amp抗性平板上生长而不能在Kan抗性平板上生长的单菌落，接种到LB无抗试管中，37 ℃培养8 h，然后42 ℃ 10 h左右，涂布与LB无抗平板上划线分离单菌落；挑取单菌落在Amp和Kan平板上划线验证，在两种平板上均不生长的单菌落，利用菌落PCR验证筛选出阳性工程菌E.coliW3110ΔyqhD和E.coliW3110ΔglpR。

1.2.5 高效液相色谱检测3-HP及其他副产物的方法

将待检测的发酵液经转速12 000 r/min离心2 min，取上清液经0.22 μm聚醚砜微孔滤膜过滤后，利用高效液相色谱法分析3-HP和其他副产物的含量。检测条件为：Waters 高效液相色谱仪，紫外检测器与折光示差检测器，色谱柱为Aminex HPX-87H柱，柱温60 ℃，流动相为5 mmol/L H2SO4，流速0.6 mL/min。进样量20 μL，采用外标法定量。

1.2.6 工程菌株生长及发酵产3-HP的研究

将质粒pCDFDuet-tac-gpd1-Tukgsadh和pACYCDuet-tac-dhaB1-4共转化至验证正确的敲除菌E.coliW3110ΔglpR和E.coliW3110ΔyqhD中，通过菌落PCR验证得到工程菌E.coliW3110ΔglpR (pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh/pACYCDuet- tac-dhaB1-4) 和E.coliW3110ΔyqhD (pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh/pACYCDuet-tac-dhaB1-4)。将上述2株工程菌同未敲除菌一起接种培养，在摇瓶和5L发酵罐中分别进行发酵培养，定时取样测定OD值，并留存样品进行高效液相色谱的检测。

2 结果与分析

2.1glpR基因敲除菌株的构建与验证

甘油抑制因子glpR属于细菌调控蛋白DeoR超家族，它抑制了整个甘油代谢路径，YANG等发现该基因调控着整个甘油代谢途径，且与甘油磷酸脱氢酶glpD的基因序列相似[15-16]。JUNG等人比较了甘油代谢途径中的glpR基因对甘油三磷酸脱氢酶基因glpT、厌氧甘油三磷酸脱氢酶基因glpA、好氧甘油三磷酸脱氢酶基因glpD、甘油异化蛋白因子glpF和甘油激酶基因glpK等基因表达水平的影响，结果显示在敲除glpR基因后，上述酶的表达量都有明显提升[12]。因此为了解除glpR对甘油代谢中的抑制作用，本实验中考察了在宿主菌基因组中敲除glpR基因对甘油代谢和3-HP产量的影响。

2.1.1 筛选阳性克隆E.coliW3110ΔglpR

甘油抑制因子glpR基因的敲除是以E.coliK12-glpR::kan基因组DNA为模版，利用PCR扩增出和glpR基因含有相同的上下同源臂的glpR::kan打靶片段并进行纯化；然后制备含有pKD46的E.coliW3110电转感受态，再将纯化后的打靶片段通过电击转化导入到E.coliW3110中，经菌落PCR验证，由图2A所示，片段1-5大小与阳性对照一致，证明Kan抗性成功替代了E.coliW3110菌株染色体上的甘油抑制因子的基因位置；之后通过导入pCP20质粒消除Kan抗性，经菌落PCR后，结果如图2B所示，阴性对照是以E.coliK12-glpR::kan基因组为模板扩增的打靶片段长度1723 bp，理论上卡那抗性基因消除的菌株经过敲除引物扩增，仅有同源臂距离大小，约450 bp左右，结果显示条带2、3大小与理论相符合，因而可以确定该菌株中的卡那抗性消除，通过测序，最终确定该菌株为E.coliW3110ΔglpR。

A: M -2000bp marker; control -阳性对照 条带1～5 -glpR::kan打靶片段的菌落PCR结果 B:M -5000bp marker; control -阴性对照; 条带1～3-敲除glpR基因的菌落PCR结果图2 E.coli W3110-glpR::kan和E.coli W3110ΔglpR菌落PCR验证Fig．2 Colony PCR verification of E.coli W3110-glpR:: Kan and E.coli W3110-ΔglpR

2.1.2 工程菌株E.coliW3110ΔglpR (pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh/pACYCDuet-tac-dhaB1-4)的筛选和验证

将pACYCDuet- tac-dhaB1-4质粒和pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh质粒导入E.coliW3110ΔglpR的感受态细胞中，采用引物dhaB1-4-F/dhaB1-4-R和K-F/K-R进行菌落PCR验证，结果如图3所示，菌落PCR扩增出约4714 bp的dhaB1-4(图3A)和1 454 bp的TUkgsadh(图3B)基因，阳性对照是为以K.pneumoniaeDSM 2026基因组和pET-28(b)-TUkgsadh为模板扩增的结果，通过比对大小一致，这说明获得了敲除了glpR基因的工程菌RH002，即E.coliW3110 ΔglpR(pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh/pACYCDuet-tac-dhaB1-4)。

A: M -5 000bp marker; control -阳性对照;条带1～3-工程菌株RH002 dhaB1-4基因菌落PCR结果 B: M-5 000bp marker; control -阳性对照;条带1～3-工程菌株RH002 TUkgsadh基因菌落PCR结果图3 工程菌E.coli W3110ΔglpR(pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh/pACYCDuet-tac-dhaB1-4)菌落PCR验证Fig.3 Colony PCR verification of E.coli W3110ΔglpR(pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh/pACYCDuet-tac-dhaB1-4)

2.2yqhD基因敲除菌株的构建与验证

2.2.1 筛选阳性克隆E.coliW3110ΔyqhD

乙醛脱氢酶基因yqhD基因的敲除是以E.coliK12-yqhD::kan基因组DNA为模版，利用PCR扩增出和yqhD基因含有相同的上下同源臂的yqhD::kan打靶片段并进行纯化；然后制备含有pKD46的E.coliW3110电转感受态，再将纯化后的打靶片段通过电击转化导入到E.coliW3110中，经菌落PCR验证，如图4A所示，片段1～3大小与阳性对照一致，证明Kan抗性成功替代了E.coliW3110菌株染色体上醛脱氢酶的基因位置；之后通过导入pCP20质粒消除Kan抗性，经菌落PCR后，结果如图4B所示，理论上卡那抗性基因消除的菌株经过敲除引物扩增，仅有同源臂距离大小，约450 bp左右，结果显示条带2，4，5大小与理论相符合，因而可以确定该菌株中的卡那抗性消除，通过测序，最终确定该菌株为E.coliW3110ΔyqhD。

A: M-2 000bp marker; control -阳性对照; 条带1～3 -yqhD::kan打靶片段的菌落PCR结果 B:M -5 000bp marker; control -阴性对照; 条带1～5-敲除yqhD基因的菌落PCR结果图4 E.coli W3110-yqhD::kan和E.coli W3110Δ yqhD菌落PCR验证Fig.4 Colony PCR verification of E.coli W3110-yqhD::Kan and E.coli W3110-ΔyqhD

2.2.2 工程菌株E.coliW3110ΔyqhD(pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh/pACYCDuet-tac-dhaB1-4)的筛选和验证

将pACYCDuet- tac-dhaB1-4质粒和pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh质粒导入E.coliW3110ΔyqhD的感受态细胞中，采用引物dhaB1-4-F/dhaB1-4-R和K-F/K-R进行菌落PCR验证，结果如图5所示，菌落PCR扩增出约4 714 bp的dhaB1-4(图5A)和1 454 bp的TUkgsadh(图5B)基因，阳性对照是为以K.pneumoniaeDSM 2026基因组和pET-28(b)-TUkgsadh为模板扩增的结果，通过比对大小一致，这说明获得了敲除了yqhD基因的工程菌RH003，即E.coliW3110ΔyqhD (pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh/pACYCDuet-tac-dhaB1-4)。

A: M -5 000bp marker; control -阳性对照;条带1,2-工程菌株RH003 dhaB1-4基因菌落PCR结果B: M-2 000 bp marker; control -阳性对照;条带1,2-工程菌株RH003 TUkgsadh基因菌落PCR结果图5 工程菌E.coli W3110Δ yqhD (pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh/pACYCDuet-tac-dhaB1-4)菌落PCR验证Fig．5 Colony PCR verification of E.coli W3110ΔyqhD (pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh/pACYCDuet-tac-dhaB1-4)

2.3工程菌的摇瓶发酵生产3-HP

将原始工程菌RH001(dhaB1-4,gpd1-TUkgsadh)以及敲除glpR和yqhD的工程菌株RH002(ΔglpR,dhaB1-4,gpd1-TUkgsadh)和RH003(ΔyqhD,dhaB1-4,gpd1-TUkgsadh)以相等的OD值分别接种到含100 mL发酵培养基的250 mL摇瓶中，在37 ℃，150 r/min条件下生长至OD600值为0.6时，加入0.05 mmol/L IPTG，28 ℃诱导，定时取样测定OD计算干重和3-HP及其他副产物的产量。如图6所示，由于基因缺失，RH002和RH003的菌体量均低于原始菌株。相比3-HP产量，发酵35 h后RH002产量达到2.86 g/L，比RH001(0.43 g/L)提高了6.7倍，3-HP得率为0.19 g/g甘油。RH003产量达到2.53 g/L，比RH001提高了5.8倍，3-HP得率为0.20 g/g甘油。同时，RH001的副产物主要有乙酸(0.24 g/L)、乳酸(0.29 g/L)、甲酸(1.22 g/L)和1,3-PDO(1.24 g/L)，敲除glpR基因的RH002中乳酸已低于检测限，其他副产物乙酸(0.08 g/L)、甲酸(1.18 g/L)和1,3-PDO(0.86 g/L)也有明显降低，而敲除yqhD基因的RH003中1,3-PDO不再生成，其他副产物乙酸(0.05 g/L)、乳酸(0.01 g/L)也显著降低(结果未列出)。上述结果说明敲除副产物和旁支途经可以有效地提升目的产物3-HP的产量并降低副产物的量。

图6 摇瓶发酵工程菌株RH001, RH002 and RH003的细胞干重(A)和3-HP产量(B)Fig 6 The dry cell weight (A) and 3-HP production (B) of recombinants RH001, RH002 and RH003

2.4工程菌株5L罐发酵生产3-HP

在摇瓶发酵培养的实验中，菌株RH002获得了较高的3-HP产量，为了进一步检测RH002产3-HP的能力，在含有3 L发酵培养基的5 L发酵罐中发酵培养控制pH 7.0(如图7)，初始甘油质量浓度为30 g/L，补料时加入质量浓度为500 g/L的甘油以维持发酵培养基中甘油的浓度，经过45 h的发酵培养，RH002的3-HP产量达到了15.4 g/L，甘油消耗量为34.98 g/L，3-HP的产率达到0.44 g/g甘油，比RH001在摇瓶中的得率显著提高。由此可知，glpR的敲除能够提高甘油易化蛋白的活性，促进胞内的甘油能够更多地用于菌体生长和3-HP的合成。

图7 工程菌RH002在5L罐发酵中的发酵曲线Fig7 Fermentation curve of recombinants RH002 in 5 L bioreactor

3 结论

实验室前期构建了利用甘油合成3-HP的重组大肠杆菌，本实验在此基础上采用同源重组的方法，敲除了甘油代谢过程中的甘油抑制因子glpR以及合成副产物1,3-丙二醇的主要基因yqhD，经过抗性筛选，获得阳性转化子，经过PCR和测序验证，证明2个基因分别被敲除，获得了重组菌株RH002和RH003。实验结果表明两个基因的敲除明显改变了甘油的利用率和副产物的代谢途径，提高了3-HP的产量。特别是在敲除甘油抑制因子glpR后，菌体更快达到稳定期，使得3-HP在5 L发酵罐中产量达到15.4 g/L，甘油利用率0.44 g /g甘油。后续的研究将集中于调节优化酶的表达，辅酶再生和优化工艺过程，更加有效的提升3-HP的产量。

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MetabolicengineeringofEscherichiacolifor3-hydroxypropionicacidproduction

CHENG Xiu-li1, 2, QIN Hai-bin1, 2, XIONG Tao1, 2, NIU Kun1, 2*

1 (Key Laboratory of Bioorganic Synthesis of Zhejiang Province, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China) 2 (Engineering Research Center of Bioconversion and Biopurification of the Ministry of Education, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

3-Hydroxypropionic acid (3-HP) is an important platform chemical that can be used to synthesize a range of chemical compounds. To improve 3-HP production, theE.coliW3110ΔyqhD (pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh/pACYCDuet-tac-dhaB1-4) was genetically modified by homologous recombination technology to knockout acetaldehyde dehydrogenase (yqhD). The recombinant strain produce 2.53 g/L 3-HP of flask culture, the production was increased 5.8 times compared with original one. On the other hand, theE.coliW3110ΔglpR (pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh/pACYCDuet-tac-dhaB1-4) was genetically modified to knockout glycerol regulatory factor (namedglpR). The recombinant strain produces 2.86 g/L 3-HP of flask culture, which was 6.7 times higher than that of the original strain. Finally, the strain ofE.coliW3110?glpR (pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh/pACYCDuet-tac-dhaB1-4) could produce 15.4 g/L 3-HP in a 5-L fermentor. The results provide research basis for 3-HP production.

3-hydroxypropionic acid (3-HP); glycerol metabolism; gene knockout; recombinantEscherichiacoli

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014181

硕士研究生(牛坤副教授为通讯作者,E-mail:niukun@zjut.edu.cn)。

国家自然科学基金(21306173)；浙江省自然科学基金青年基金(LQ15C010001)

2017-03-01，改回日期：2017-03-23