iRoot BP对人乳牙牙髓细胞增殖、矿化的影响

战园，刘鹤

(1北京大学口腔医学院口腔医院第三门诊部，北京100081；2北京大学口腔医学院口腔医院)

iRoot BP对人乳牙牙髓细胞增殖、矿化的影响

战园1，刘鹤2

(1北京大学口腔医学院口腔医院第三门诊部，北京100081；2北京大学口腔医学院口腔医院)

目的 探讨iRoot BP对人乳牙牙髓细胞增殖、矿化的影响，为其用于乳牙活髓保存治疗提供依据。方法 将iRoot BP和三氧化矿物凝聚体(MTA)分别制成高度2 mm、直径8 mm的圆柱体，置于DMEM细胞培养基中，收集浸提液。原代培养人乳牙牙髓细胞并鉴定。随机将人乳牙牙髓细胞分为iRoot BP组、MTA组、对照组。iRoot BP组和MTA组分别加入适量iRoot BP、MTA浸提液，使其终浓度分别为10%、20%、50%、100%，对照组不予处理。采用CCK-8法检测三组培养24、72 h时细胞增殖指数，采用实时荧光定量PCR法检测三组培养48、96 h时碱性磷酸酶(ALP)mRNA表达(iRoot BP、MTA浸提液浓度均为10%)。结果 与对照组同时间点比较，含50%、100%浸提液的iRoot BP组、MTA组细胞增殖指数均降低(P均<0.05)，而含10%、20%浸提液的iRoot BP组、MTA组细胞增殖指数无明显变化(P均>0.05)。与对照组同时间点比较，iRoot BP组、MTA组ALP mRNA相对表达量均升高(P均<0.05)。iRoot BP组与MTA组作用48、96 h ALP mRNA相对表达量比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。结论 10% iRoot BP浸提液对人乳牙牙髓细胞增殖无明显影响，但可明显促进细胞矿化。

乳牙；牙髓保存；人乳牙牙髓细胞；直接盖髓材料；三氧化矿物凝聚体；细胞增殖；细胞分化

活髓保存是儿童牙髓治疗的首选方法，理想的活髓保存材料应该能够促进组织愈合，具有良好的生物相容性、封闭性、抗菌性、尺寸稳定性及操作性，能快速固化并不受潮湿环境影响等[1]。三氧化矿物凝聚体(MTA)克服了传统活髓保存材料的封闭性和生物相容性差等缺点[2]， 盖髓后牙髓组织炎性反应较轻，可促进恒牙牙髓细胞再生，形成修复性牙本质[1, 3]，目前常用于评价其他新型活髓保存材料的参照物[4]。但MTA在使用前需将粉剂和无菌注射用水混合，难以保证材料的均质性；而且其固化时间长，内含的三氧化二铋、铁、镁等成分易导致牙冠变色等[5]。iRoot BP是一种新型生物陶瓷材料，与MTA的基本组成成分类似。2016年10月～2017年1月，我们对iRoot BP与MTA在乳牙活髓保存中的效果进行了对比观察。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 乳牙牙髓细胞培养及鉴定 经患儿监护人知情同意，收集临床无明显根吸收的滞留乳牙或因外伤需拔除的乳牙。无菌条件下取出牙髓组织，弃牙髓根尖2 mm部分，将其余组织剪碎，平铺于25 cm2培养瓶内。培养瓶中加入α-MEM培养基(美国Gibco公司)，内含15% FBS(美国Gibco公司)、2 mmol/L谷氨酰胺(美国Sigma公司)、100 μmol/L左旋抗坏血酸磷酸盐(美国Sigma公司)、1×105U/L青霉素(华北制药集团有限责任公司)、100 mg/L链霉素(华北制药集团有限责任公司)，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度环境中培养。每2～3天换液1次。取传4～6代细胞，免疫组化染色，显微镜下可见乳牙牙髓细胞呈典型的长梭形，具有成纤维细胞样形态；Cytokeratin表达呈弱阳性、Vimentin表达呈强阳性。证实为原代培养的人乳牙牙髓细胞。

1.2 iRoot BP及MTA浸提液制备 将iRoot BP、MTA分别制成高度2 mm、直径8 mm的圆柱体，紫外线灭菌3 h，置于50 mL DMEM培养基(含1 mmol/L L-Glu、10% FBS)中， 37 ℃细胞培养箱中浸提24 h。将iRoot BP、MTA浸提液采用0.22 μm滤器过滤除菌，4 ℃保存备用。

1.3 iRoot BP及MTA对牙髓细胞增殖能力影响的观察 取对数生长期牙髓细胞，接种于96孔板，每孔3×103个，37 ℃、5% CO2、饱和湿度环境中培养24 h。随机将细胞分为iRoot BP组、MTA组和对照组。iRoot BP组和MTA组分别加入适量iRoot BP、MTA浸提液，使其终浓度分别为10%、20%、50%、100%，对照组不予处理。三组分别于培养24、72 h，采用CCK-8法检测450 nm波长处各孔的光密度(OD)值。细胞增殖指数=(OD实验孔-OD空白孔)/(OD对照孔-OD空白孔)×100%。实验重复3次，取平均值。

1.4 iRoot BP及MTA对牙髓细胞碱性磷酸酶(ALP)mRNA表达影响的观察 取对数生长期牙髓细胞按1×104个/cm2接种于培养瓶中，随机分为iRoot BP组、MTA组和对照组。根据1.3的结果，iRoot BP组和MTA组仅加入浓度为10% iRoot BP、MTA的浸提液，对照组不予处理。每48 h换液1次，连续培养96 h。分别收集三组培养48、96 h细胞，加入细胞裂解液，TRIzol法提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA。根据GenBank基因库公布的ALP、GAPDH(内参基因)mRNA 序列，使用Primer5.0软件设计引物。引物序列：ALP上游引物：5′-AGCACTCCCACTTCATCTGGAA-3′，下游引物：5′-GAGACCCAATAGGTAGTCCACATTG-3′，引物长度分别为22、25 bp；GAPDH上游引物：5′-CAACGGATTTGGTCGTATTGG-3′，下游引物：5′-GCAACAATATCCACTTTACCAGAGTTAA-3′，引物长度分别为21、28 bp。PCR反应体系共20 μL：Sybr Green Mix 10 μL、cDNA 0.5 μL、 Milli Q水8.5 μL和上下游引物各0.5 μmol/L。反应条件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min重复40个循环。采用2-ΔΔCt法计算各组ALP mRNA相对表达量。实验重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 三组细胞增殖指数比较 与对照组同时间点比较，含100%、50%浸提液的iRoot BP组、MTA组细胞增殖指数均降低，以含100%浸提液的iRoot BP组、MTA组细胞增殖指数降低更明显(P均<0.05)。含20%和10%浸提液的iRoot BP组、MTA组作用24、72 h细胞增殖指数与对照组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。含相同浓度浸提液的iRoot BP组、MTA组作用相同时间细胞增殖指数比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 三组细胞增殖指数±s)

2.2 三组ALP mRNA表达比较 与对照组同时间点比较，iRoot BP组、MTA组ALP mRNA相对表达量均升高(P均<0.05)。iRoot BP组与MTA组作用48、96 h ALP mRNA相对表达量比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表2 三组ALP mRNA相对表达量比较

注：与对照组同期比较，*P<0.05。

3 讨论

牙髓组织具有一定的修复能力，当其受到损伤时，原有的健康牙髓组织增殖分化并形成修复性牙本质，这是保存活髓的基础[6]。目前，保存活髓的方法主要为直接盖髓术。直接盖髓术是指在暴露的牙髓创面覆盖能使牙髓组织恢复的制剂，即盖髓剂。临床应用的盖髓剂主要有氢氧化钙和MTA。氢氧化钙作为盖髓剂时操作复杂，疗程较长，治疗成功率较低[7]。MTA中含三氧化二铋，作为阻射剂时，不仅会增加细胞毒性，抑制细胞增殖，还可能导致牙冠变色[8]。iRoot BP是保存活髓的新型材料，该材料以氧化钽、氧化锆代替了MTA中的三氧化二铋，可避免牙冠变色[9]。而且iRoot BP使用前无需调拌，可预先混合成膏状或糊状，吸收组织液或牙本质中的水分即可引发固化反应，临床操作性能优于MTA[10]。目前关于iRoot BP的研究主要集中于封闭性[11]、生物相容性[9]、成骨作用[12]等方面，其作为盖髓剂对牙髓细胞增殖及矿化影响的报道较少。

原代培养的人牙髓细胞、牙周膜细胞和牙龈上皮细胞等常作为口腔材料、药物生物安全性评价的模型[13,14]。本研究选择与盖髓材料直接接触的乳牙牙髓细胞作为研究对象，结果显示，与对照组同时间点比较，含100%、50%浸提液的iRoot BP组、MTA组细胞增殖指数均降低，而含20%、10%浸提液的iRoot BP组、MTA组细胞增殖指数则无明显变化。说明高浓度的iRoot BP、MTA浸提液可抑制人乳牙牙髓细胞增殖，而低浓度的浸提液则无明显增殖抑制作用，与以往研究[11]结果一致。因此，本研究选择10% iRoot BP、MTA浸提液进行后续实验。

ALP是与牙本质基质形成及矿化密切相关的蛋白，其表达水平可间接反映牙髓细胞向成牙本质样细胞分化，以及促进矿化、形成修复性牙本质的能力。研究证实，组织非特异型ALP可参与牙齿和骨等组织的代谢及矿化， ALP是成牙本质样细胞或成骨样细胞分化成熟的标志[14]。ALP是成骨细胞分化的早期表型标志物，其能水解磷酸酯，为羟基磷灰石的沉积提供磷酸[15]。本研究结果显示，同时间点iRoot BP组、MTA组ALP mRNA相对表达量均较对照组升高，但作用48、96 h时两组ALP mRNA相对表达量比较差异均无统计学意义。表明10% iRoot BP、MTA浸提液均能促进人乳牙牙髓细胞的矿化，且二者效果并无明显统计学差异。

综上所述，10% iRoot BP浸提液对人乳牙牙髓细胞增殖无明显影响，但可明显促进细胞矿化，具有良好的生物活性及促成骨作用。此外，iRoot BP的操作性和固化性更好，有望成为儿科临床适宜的直接盖髓材料。

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刘鹤(E-mail： heliu69@126.com)

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